放射治療與化療治療癌癥越治死得越快

   過去我一直強(qiáng)調(diào)，西醫(yī)的化學(xué)治療不但無效於各種癌癥，反而癌癥病人會(huì)因?yàn)檫@化學(xué)治療，讓原本的癌細(xì)胞擴(kuò)散到其他內(nèi)臟去，自然病情就會(huì)越來越重，等於是加速癌癥病人的快速死亡，我知道這種狀況一直在發(fā)生中，因?yàn)檫@是我的臨床經(jīng)驗(yàn)告訴我的事實(shí)，任何中醫(yī)師只要知道如何使用內(nèi)經(jīng)中的陰陽辨證法則來做診斷法的依據(jù)，也就是說對(duì)人體內(nèi)的陰陽消長非常了解的醫(yī)師，都可以知道我說的是對(duì)的，多年的治癌經(jīng)驗(yàn)告訴我，西醫(yī)學(xué)所謂的正統(tǒng)癌癥治療法如開刀、化學(xué)治療、放射線治療等，不但無助於治療癌癥，反而癌癥病人因?yàn)檫@些不當(dāng)與過度的治療，讓生活品質(zhì)變成如人間地獄般的痛苦，如果病人能夠忍受這些痛苦，而代價(jià)是多活幾年，這也還罷了，但是事實(shí)卻不是這樣，所有的臨床證據(jù)跟美國最新的癌癥研究，在在都證明了，西醫(yī)的三種必殺的治癌方法，只會(huì)讓癌癥病人壽命活得更短，完全沒有證據(jù)證明這些所謂正統(tǒng)的治療方式，可以延長病人的壽命，這種超爛的醫(yī)學(xué)治療法，現(xiàn)在還被臺(tái)灣的西醫(yī)在沾沾自喜中，自命是正統(tǒng)的治療，對(duì)中醫(yī)學(xué)還不屑一顧，我個(gè)人認(rèn)為只要是對(duì)病人有利的，我們就不該反對(duì)，Why not? 對(duì)不對(duì)，但是我必須要說實(shí)話，因?yàn)楝F(xiàn)在在臺(tái)灣每年都在上昇的癌癥病患指數(shù)，證明了臺(tái)灣在醫(yī)學(xué)方面已經(jīng)走錯(cuò)方向，這個(gè)方向再不做修正，未來還會(huì)有更多的可愛臺(tái)灣人民，痛苦又快速的死於癌癥，請(qǐng)問讀者們，如果我不出面說明，誰敢出面說出這些真話呢? 下面提供一則美國對(duì)癌癥治療的研究報(bào)告，放射治療與化學(xué)治療反而會(huì)加速癌癥的快速擴(kuò)散，希望臺(tái)灣民眾因此而覺醒過來，不要再沉迷於西醫(yī)的癌癥治療法了，請(qǐng)盡快找中醫(yī)幫你們吧，如果找不到可以信任的中醫(yī)師，可以來傳真，表明你的真實(shí)身分，我來幫你介紹推薦吧。

   為了避免失真，所以我放進(jìn)去的是原文，如果有同學(xué)願(yuàn)意將之翻譯成中文，再寄來給我，我就會(huì)再放在此處供讀者閱覽。

手術(shù)化療與放射線療會(huì)對(duì)腫瘤加速擴(kuò)散的研究，(原文翻譯doc檔)          手術(shù)化療與放射線療會(huì)對(duì)腫瘤加速擴(kuò)散的研究，(原文翻譯pdf檔)

    2009年04月04日更新 感謝這位網(wǎng)友的協(xié)助，將這篇原文翻譯成中文，以便讓讀者可以很輕易的閱讀這篇研究報(bào)告，只有大家同心協(xié)力，才有機(jī)會(huì)將最正確的醫(yī)學(xué)訊息傳播出去，讓世間所有的病人都能得到最好的醫(yī)療照顧，我們都很期這一天的到來，我替所有支持我們經(jīng)方家的網(wǎng)友們，跟您說聲謝謝，謝謝你替大家辛勞的付出，我心中能說的只有感謝再感謝。

期刊：

臨床研究期刊 (The Journal of Clinical Investigation)  Volume 117  Number 5  May 2007

標(biāo)題：

以中和抗體抑制腫瘤成長因子β 可避免因放射治療引起的腫瘤加速轉(zhuǎn)移

(Inhibition of TGF-β with neutralizing antibodies prevents radiation-induced acceleration of metastatic cancer progression)

作者

Swati Biswas,¹ Marta Guix,² Cammie Rinehart,² Teresa C. Dugger,² Anna Chytil,¹

Harold L. Moses,^1,3,4 Michael L. Freeman,⁵ and Carlos L. Arteaga^1,2,4

單位

屬於美國田納西州 那什維爾 范德堡大學(xué)(Vanderbilt University)

1.癌癥生物學(xué)系、2.醫(yī)學(xué)系、3.病理學(xué)系、4. Vanderbilt-Ingram癌癥中心乳癌研究計(jì)畫 以及 5.放射腫瘤學(xué)系

摘要

        我們探究了因癌癥治療而產(chǎn)生的TGF-β究竟會(huì)不會(huì)加速腫瘤的發(fā)生。我們使用了MMTV/PyVmT 此一轉(zhuǎn)移型乳癌基因的轉(zhuǎn)殖模型，指出了游離輻射（譯註1）或doxorubicin（譯註2）都會(huì)增加循環(huán)中TGF-β1與腫瘤細(xì)胞的量，並會(huì)增加肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。這些效應(yīng)都因?yàn)槲覀兪褂昧朔?/span>TGF-β抗體而受抵銷。我們?cè)谟?/span>TGF-β抗體的環(huán)境下，體外培養(yǎng)了這些在循環(huán)中會(huì)表現(xiàn)多瘤病毒中等T抗原（譯註3）的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們不會(huì)生長；這表示TGF-β在這些細(xì)胞中是一種生存的訊號(hào)。當(dāng)老鼠的腫瘤不含有第二型TGF-β受器時(shí)，放射線就不會(huì)增加肺部的癌癥轉(zhuǎn)移；這顯示至少在部分上，肺癌轉(zhuǎn)移是跟TGF-β在腫瘤細(xì)胞上的直接作用有關(guān)的。這些數(shù)據(jù)含示，癌癥治療所產(chǎn)生的TGF-β是一種幫助癌癥轉(zhuǎn)移的訊號(hào)，也提供了一個(gè)原理根據(jù)，讓我們得在癌癥治療時(shí)同時(shí)使用TGF-β抑制劑。

譯註1：此為放射性治療。

譯註2：此為一癌癥化學(xué)治療常用藥物，俗稱「小紅莓」。

譯註3：此為感染此病毒之初期的產(chǎn)生的三種T抗原中其中一種。

介紹

        腫瘤成長因子TGF-β，既是一個(gè)腫瘤抑制基因，也是一個(gè)腫瘤啟動(dòng)子。當(dāng)TGF-β配體(ligands)結(jié)合到與其對(duì)應(yīng)的絲胺酸/酥胺酸(Ser/Thr)激酶跨胞膜受器後，這些受器接著就會(huì)磷酸化、活化Smad族的訊息傳遞者。被活化之後，Smad 2、Smad 3 會(huì)與 Smad 4 結(jié)合並遷移至細(xì)胞核內(nèi)，在此處調(diào)控與細(xì)胞週期停止(cell cycle arrest)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)相關(guān)的基因之轉(zhuǎn)錄。TGF-β之所以有腫瘤抑制基因之用，即係此項(xiàng)調(diào)控之功。的確，在內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)中的TGF-β訊息傳遞，若是喪失或減弱，都會(huì)讓內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化(transformation)大行其道。另一方面，已有研究顯示，若將顯性且無效的TGF-β受器引入至移轉(zhuǎn)的癌癥細(xì)胞中，從上皮細(xì)胞型態(tài)轉(zhuǎn)變成間葉細(xì)胞型態(tài)的轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal  transdifferentiation)、能動(dòng)性(motility)、侵略性(invasiveness)、以及存活率(survival)均會(huì)受到抑制。這證明在已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，TGF-β扮演了一個(gè)腫瘤啟動(dòng)子的角色（於參考文獻(xiàn)4中有回顧）。大部分的癌都保有TGF-β受器，卻喪失或部分喪失了Smad依賴性的抗細(xì)胞分裂效應(yīng)(Smad-dependent antimitogenic effect)；同時(shí)，在某些個(gè)案中，他們還會(huì)對(duì)TGF-β有所反應(yīng)，而獲得了幫助癌癥轉(zhuǎn)移的能力。進(jìn)而，不論癌癥細(xì)胞過度生產(chǎn)TGF-β、過度活化TGF-β，或是兩者兼?zhèn)洌�都�?huì)藉由旁泌(paracrine)的方式，改變腫瘤周圍的微小環(huán)境(microenvironment)，幫助腫瘤的發(fā)生。這些資料提供了支持根據(jù)，讓我們得以設(shè)法阻斷人類癌癥中的自泌性(autocrine)或旁泌性(paracrine)之TGF-β訊息傳遞，以達(dá)治療之目的。

        除Smad族的蛋白質(zhì)外，TGF-β還可以刺激數(shù)種轉(zhuǎn)化的訊息傳遞路徑。之前TGF-β已被證實(shí)可保護(hù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞(transformed cells)不受細(xì)胞凋亡之害。此類細(xì)胞反應(yīng)有一種可能的機(jī)制，就是TGF-β誘發(fā)了PI3K和PI3K的標(biāo)的物，也就是絲胺酸/酥胺酸激酶 Akt，此訊息傳遞程序和對(duì)於癌癥藥物的抗藥性是相關(guān)連的。有些對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)療法有抗藥性的腫瘤會(huì)過度表現(xiàn)TGF-β，而TGF-β的抑制劑經(jīng)證明可逆轉(zhuǎn)此種抗藥性。還有，大部分的腫瘤都會(huì)過度表現(xiàn)TGF-β配體(ligands)。在腫瘤組織與在血清中的高量TGF-β配體，與腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)、患者較差的癒後，均有所相關(guān)。

        在乳癌的基因轉(zhuǎn)殖模型中，TGF-β之訊息傳遞可加強(qiáng)轉(zhuǎn)移既存的乳腺腫瘤。這是受例如Neu/ErbB2或多腺瘤病毒中央Ｔ抗原(polyomavirus middle T antigen, PyVmT)等的癌癥基因之誘發(fā)所致。再者，在MMTV/LTR乳腺啟動(dòng)子的控制下，表現(xiàn)PyVmT癌癥基因的基因轉(zhuǎn)殖鼠，經(jīng)過有條件的TGF-β1誘導(dǎo)，只要兩個(gè)禮拜之短，轉(zhuǎn)移肺癌的機(jī)率便高了十倍。有些癌癥治療已被證實(shí)會(huì)全面性地、或留在原處誘發(fā)TGF-β。所以我們推測(cè)，被癌癥治療所誘發(fā)的TGF-β，會(huì)提供存活訊息給這些對(duì)化療有抗藥性的腫瘤裡的細(xì)胞，或者一部分此種腫瘤中的細(xì)胞，使它們可能在治療之後，立即加速腫瘤的擴(kuò)展。在此，我們使用了乳癌轉(zhuǎn)移的MMTV/PyVmT 基因轉(zhuǎn)殖模型來展示，游離輻射(ionizing radiation)和小紅莓(doxorubicin)提高了循環(huán)中的TGF-β1濃度、循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞數(shù)、以及肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。這些效應(yīng)都藉由TGF-β中和抗體的施加，而得以抵銷。在缺乏第二型TGF-β受器(TβRII)的老鼠身上，放射線則沒有增加肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。這些資料暗示，癌癥治療所產(chǎn)生的TGF-β是腫瘤中一個(gè)幫助癌癥轉(zhuǎn)移的訊號(hào)，因此也提供了原理根據(jù)，使我們?cè)谑褂眠@些療法時(shí)，得以同時(shí)搭配使用TGF-β的抑制劑。

結(jié)果

        胸腔放射線處理與化學(xué)治療提高了循環(huán)中的TGF-β量。我們?cè)诎诉L大的未交配母鼠之胸腔與骨盆內(nèi)，施加了10 Gy的放射線。在施加放射線之後隔24小時(shí)，進(jìn)行血液採集。我們?cè)谑芊派涮幚碇�老鼠的血漿裡，觀察到約為控制組2倍的TGF-β1含量 （胸腔，P=0.03；骨盆，P=0.02；圖一A）；同時(shí)，TGF-β2的量沒有改變（資料未呈現(xiàn)）。在八週大的MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠中，或是在種下MMTV/PyVmT腫瘤細(xì)胞、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了luciferase 表現(xiàn)載體的非基因轉(zhuǎn)殖鼠中，我們都得到類似的結(jié)果（分別為P=0.015與P=0.007，相較於控制組，圖一B）。在經(jīng)過放射處理後，TGF-β1的濃度有持續(xù)七天比控制組高（資料未呈現(xiàn)）。為了將這些結(jié)果推廣到其他的癌癥治療法，我們測(cè)試了DNA嵌入劑(DNA-intercalating agent)與topoisomerase II之抑制劑 doxorubicin（Adriamycin）的效果如何。從第八週開始，基因轉(zhuǎn)殖鼠被施行三次腹腔注射doxorubicin (5 mg/kg i.p.)，每次分別間隔21天。在第十五週收集到的血漿裡發(fā)現(xiàn)，相較於未處理的老鼠，TGF-β1濃度提高了兩倍(P = 0.009；圖一C)，而TGF-β2濃度則是持平不變。為了要測(cè)量在放射處理後五週所取得的肺臟組織中，被活化的TGF-β1之濃度，我們使用了一種TGF-β1生物檢驗(yàn)來檢測(cè)，這檢測(cè)是使用一種會(huì)穩(wěn)定表現(xiàn)plasminogen activator inhibitor-1/luciferase reporter (PAI-1/luciferase reporter) 的貂肺內(nèi)皮細(xì)胞來運(yùn)作的。相較於未受放射處理之老鼠肺組織裂解液，經(jīng)過放射線處理的老鼠肺組織裂解液，誘導(dǎo)提升了有2倍多的TGF-β1濃度（P=0.0008；圖一D）。

        胸腔的放射線處理及化學(xué)治療，會(huì)增加循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞量與增加肺部癌癥轉(zhuǎn)移。TGF-β增強(qiáng)了會(huì)表現(xiàn)PyVmT腫瘤基因之腫瘤細(xì)胞的存活率，而且之前已被證實(shí)，TGF-β有條件地被誘發(fā)後，會(huì)在MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠中加速乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，我們推測(cè)，因治療而提升的循環(huán)中TGF-β1濃度，可能和這個(gè)乳癌轉(zhuǎn)移模型中的循環(huán)中腫瘤細(xì)胞增加、肺部癌癥轉(zhuǎn)移增加，有所關(guān)連。帶有腫瘤的MMTV/PyVmT老鼠在第八週大時(shí)，被施行胸腔放射處理(thoracic irradiation)(10 Gy)直至第十三週為止。實(shí)驗(yàn)終結(jié)時(shí)進(jìn)行心臟穿刺以取得血液，而血液中的細(xì)胞部分，則拿去測(cè)試其在活體外生成細(xì)胞集落之能力。從未經(jīng)放射處理之老鼠所取得之血液，產(chǎn)生了平均1.6 ± 1.5個(gè)細(xì)胞集落；而從經(jīng)過放射處理之老鼠所取得之血液，於10-12天後所測(cè)量的結(jié)果是，產(chǎn)生了平均28.3 ± 7.6個(gè)細(xì)胞集落（P=0.02：圖二A）。PyVmT抗體的免疫染色證實(shí)，這些生長的細(xì)胞集落有表現(xiàn)癌癥基因（圖二A）。循環(huán)中的活腫瘤細(xì)胞數(shù)有所增加；而和此相符合的是，我們?cè)诮?jīng)放射處理的老鼠中，觀察到較未經(jīng)處理之控制組17倍的肺部表面癌癥轉(zhuǎn)移（P = 0.009；圖二B）。在被用doxorubicin處理相較於未處理之老鼠中，也在肺部癌癥轉(zhuǎn)移觀察到類似的上升情形（P = 0.032；圖二C）。在施加doxorubicin 24小時(shí)之後，相較於未經(jīng)處理之控制組老鼠所取得之血液，也觀察到在細(xì)胞群落數(shù)目的上升（17.2 ± 3.7與7.2 ± 2 colonies; n = 5; P = 0.007)。從老鼠的體重及一系列的腫瘤直徑數(shù)據(jù)來看，受處理與未處理的老鼠在腫瘤負(fù)荷量上並無差異，這表示TGF-β1濃度之差別，不能簡(jiǎn)單地以腫瘤負(fù)荷量會(huì)隨時(shí)間增加來解釋。

        接下來，我們檢驗(yàn)了放射線所誘發(fā)之肺部癌癥轉(zhuǎn)移，是否僅限於帶有腫瘤的MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠身上。為了測(cè)試這個(gè)可能性，我們從會(huì)表現(xiàn)PyVmT之基因轉(zhuǎn)殖的乳腺癌中，取得表現(xiàn)luciferase的腫瘤細(xì)胞，然後將其注射至非基因轉(zhuǎn)殖的同源FVB老鼠身上。這些老鼠中的腫瘤，生長在左側(cè)鼠蹊(inguinal)（四號(hào)）的乳腺脂肪墊，我們以生物發(fā)光法，觀察並估計(jì)了其轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至肺臟的情形（圖三A）。當(dāng)腫瘤長到了200mm³或更大時(shí)，老鼠在胸腔施加了10 Gy 的放射線並在其餘部分施加屏障，兩週後將老鼠犧牲。相較於控制組，接受放射處理的老鼠增加了三倍的表面肺部癌癥轉(zhuǎn)移(P = 0.005; 圖三，B和C)。再者，在放射處理後24小時(shí)與兩週之後，分別有相較於控制組多8倍與5倍的循環(huán)中腫瘤細(xì)胞量（表一）。在實(shí)驗(yàn)組與控制組間，原發(fā)腫瘤的生長率並無不同（資料未呈現(xiàn)）。

        將培養(yǎng)中的PyVmT細(xì)胞暴露在1.25 - 7.50 Gy下，會(huì)增加其產(chǎn)生TGF-β的量（圖四A）。在以上所述之研究過程中，有既成之腫瘤的老鼠才會(huì)施加放射線處理；循環(huán)中TGF-β濃度的增加，有可能是因?yàn)榉派渚�在癌癥細(xì)胞上的作用，因此我們想排除掉這個(gè)可能。我們對(duì)未交配的FVB母鼠施加了10 Gy的胸腔放射。在放射處理後一個(gè)小時(shí)，我們從尾部靜脈注入了表現(xiàn) PyVmT 且受 luciferase 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stably transfected)的腫瘤細(xì)胞。肺臟中的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷量(tumor cell burden)，是在腫瘤細(xì)胞的注入之後，使用活體內(nèi)(in vivo)與活體外(ex vivo)的生物發(fā)光來監(jiān)測(cè)的。經(jīng)放射線處理的老鼠肺臟，表現(xiàn)了較控制組為高的生物發(fā)光訊號(hào)（圖四B），此訊號(hào)與人工計(jì)數(shù)之表面肺癌轉(zhuǎn)移數(shù)量是相關(guān)連的，亦與肺臟重量相關(guān)（圖四，C與D）。

        TGF-β中和抗體阻斷了受放射線誘導(dǎo)增加之肺部癌癥轉(zhuǎn)移。我們使用了2G7中和泛TGF-β IgG2抗體 (2G7 neutralizing pan-TGF-β IgG2)來驗(yàn)證，放射線所誘導(dǎo)增加的循環(huán)中TGF-β濃度，是否在肺癌轉(zhuǎn)移中扮演一個(gè)成因的角色。這個(gè)單株抗體阻斷了所有三種哺乳類所具有的TGF-β異構(gòu)物，並且在活體中有活性。八週大的MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠，在胸腔放射處理的2小時(shí)之前，以15mg/kg 之2G7或PBS注射至腹腔中。這些處理持續(xù)每週兩次，到第十三週為止，此時(shí)將老鼠犧牲並測(cè)量是否肺部有癌癥轉(zhuǎn)移。然而有趣的是，施打2G7到未經(jīng)放射線處理的老鼠中，少許增加了肺癌轉(zhuǎn)移，但在統(tǒng)計(jì)上並不顯著（圖五A和B）。在兩種實(shí)驗(yàn)組別之間，並未存在原發(fā)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷量的差異（資料未呈現(xiàn)）。

        我們收集了血液並體外培養(yǎng)其細(xì)胞懸浮液，以估計(jì)在循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞量。從未經(jīng)放射處理與經(jīng)過放射處理的老鼠身上，血液中取得而培養(yǎng)的細(xì)胞群落數(shù)，均因施加2G7而顯著地減少（圖五C）。最後，我們檢驗(yàn)了在體外添加2G7以抑制TGF-β，是否會(huì)阻止老鼠血液中取得之腫瘤細(xì)胞群落生長。將帶有腫瘤、經(jīng)過放射處理的老鼠所取得之血液，接種於含有2G7與不含有2G7的環(huán)境下，而在十天之後評(píng)估其集落生長情形。將細(xì)胞培養(yǎng)在存有2G7的環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)會(huì)降低70%的細(xì)胞群落數(shù)（圖五D），這表示自泌性的(autocrine) TGF-β對(duì)於表現(xiàn)PyVmT的循環(huán)中癌癥細(xì)胞，是一種存活因子。

        放射線誘導(dǎo)增加肺部癌癥轉(zhuǎn)移，需要腫瘤細(xì)胞內(nèi)的TGF-β受器。以上描述的結(jié)果顯示，因放射線誘導(dǎo)之循環(huán)中TGF-β濃度提升，是對(duì)於循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的存活信號(hào)，讓細(xì)胞可以移居至肺臟、在肺臟裡生長。因此我們推論，藉由移除細(xì)胞對(duì)循環(huán)中TGF-β的反應(yīng)，以使得TβRII 不存在於MMTV/PyVmT腫瘤中，就可以抵銷放射處理在癌癥轉(zhuǎn)移上的效應(yīng)。為檢驗(yàn)此推論之可能，我們使用了表現(xiàn)PyVmT的腫瘤細(xì)胞，並且用Cre-Lox技術(shù)將TβRII有條件地於細(xì)胞中移除。含有或未含TGFBR2的PyVmT表現(xiàn)型腫瘤細(xì)胞株（在此之後將稱為PyVmT/TGFBR2^flox/flox or PyVmT/TGFBR2^KO）是分別從PyVmT/TGFBR2^flox/flox 及 PyVmT/TGFBR2^KO老鼠身上的乳腺癌所產(chǎn)生。PyVmT/TGFBR2^flox/flox 及PyVmT/TGFBR2^KO細(xì)胞株均以luciferase之載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，且經(jīng)由尾部靜脈注射入八週大、未交配的FVB母鼠，這些母鼠有些沒有經(jīng)過放射線處理，有些則是在注射腫瘤細(xì)胞之前1小時(shí)，施加了10 Gy的胸腔放射。兩週後估計(jì)肺部癌癥轉(zhuǎn)移情形。在被注射PyVmT/TGFBR2^flox/flox 細(xì)胞的老鼠裡，經(jīng)放射處理之老鼠相較於控制組老鼠，發(fā)現(xiàn)生物發(fā)光訊號(hào)有所增加、肺部癌癥轉(zhuǎn)移增加6倍；但如果老鼠之前是被注射不含有TβRII的細(xì)胞，在施加與未施加放射處理的兩組中，便沒有差別（圖六，A-C）。PyVmT/TGFBR2^KO 的腫瘤結(jié)節(jié)比 PyVmT/TGFBR2^flox/flox 的腫瘤結(jié)節(jié)還大，此結(jié)果與之前的一項(xiàng)報(bào)告是相符合的，也就是說，PyVmT表現(xiàn)型乳癌細(xì)胞之TβRII喪失，會(huì)增進(jìn)肺部癌癥轉(zhuǎn)移的生長。經(jīng)PCR擴(kuò)增腫瘤組織中取得之DNA證實(shí)了在 PyVmT/TGFBR2^KO細(xì)胞中，是存在基因重組的（圖六D）。

討論

        我們?cè)诨�因轉(zhuǎn)殖老鼠的乳癌轉(zhuǎn)移模型中，研究了癌癥治療所誘發(fā)的TGF-β是否會(huì)加速腫瘤的發(fā)生。在MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠中，在肺部施加游離輻射或是以doxorubicin處理，都增加了循環(huán)中的TGF-β1量、循環(huán)中腫瘤細(xì)胞數(shù)以及肺部癌癥轉(zhuǎn)移。循環(huán)中TGF-β1濃度增加、之後的癌癥轉(zhuǎn)移增加，並不需要老鼠在施加處理時(shí)就擁有腫瘤，就如同我們也在放射處理後才施打腫瘤細(xì)胞的老鼠中所觀察到的。TGF-β1會(huì)增加，並不僅限於受到胸腔放射處理的誘導(dǎo)，因?yàn)槲覀冊(cè)诠桥璧姆派涮幚怼⒁约叭�面性施�?/span>doxorubicin下，也都觀察到了TGF-β1的受誘導(dǎo)增加。在放射處理後，循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的增加以及腫瘤轉(zhuǎn)移的增加，都因到2G7的施加而抵銷。重要的是，循環(huán)中PyVmT表現(xiàn)型腫瘤細(xì)胞無法在有2G7的環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)，這也就表示了自泌性(autocrine)TGF-β對(duì)這些細(xì)胞是一種存活的訊號(hào)。這些結(jié)果與之前兩項(xiàng)研究是相吻合的；在這些研究中，以可溶性TβRII:Fc融合蛋白、或用反義TGF-β1(antisense TGF-β1)穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染加以阻斷TGF-β，都抑制了腫瘤細(xì)胞的能動(dòng)性、存活率、滲入(intravasation)以及肺部癌癥轉(zhuǎn)移。

        老鼠身上的腫瘤不含TβRII，放射線便無法在這些老鼠身上加強(qiáng)肺部癌癥轉(zhuǎn)移。為了展示此點(diǎn)，我們從PyVmT/TGFBR2^flox/flox 與 PyVmT/TGFBR2^KO之老鼠身上既成之乳腺腫瘤，取得細(xì)胞株來使用。Forrester等人曾經(jīng)提出報(bào)告，以MMTV/Cre表現(xiàn)有條件地使TGFBR2缺失時(shí)，這些knockout PyVmT表現(xiàn)型的腫瘤發(fā)生潛伏期就變短了許多，並且表現(xiàn)出明顯增加的肺部癌癥轉(zhuǎn)移，這是相較於PyVmT/TGFBR2^flox/flox型的腫瘤。因?yàn)槲覀兪褂昧遂o脈注射法，並且，我們所注入細(xì)胞株是從既成之含有TβRII與未含TβRII的腫瘤而來，所以我們的結(jié)果無法解釋Forrester等人所報(bào)導(dǎo)之癌癥潛伏與轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)。儘管我們?cè)诮?jīng)放射處理的老鼠中無法排除TGF-β之增加，是否會(huì)影響宿主的微環(huán)境(microenvironment)與/或免疫系統(tǒng)，並進(jìn)而幫助了腫瘤轉(zhuǎn)移之進(jìn)行，我們不含有TβRII之腫瘤的結(jié)果卻強(qiáng)烈地顯示，癌癥轉(zhuǎn)移之增加至少在部分上，是肇因於TGF-β在癌癥細(xì)胞的直接作用。

        在腫瘤細(xì)胞中，這些潛在受循環(huán)中TGF-β濃度調(diào)控的訊號(hào)反應(yīng)，目前仍屬未明。然而，TGF-β的助癌轉(zhuǎn)移效應(yīng)並不僅限於此基因轉(zhuǎn)殖模型。舉例說明，在MMTV/LTR啟動(dòng)子控制下表現(xiàn)有活性的TGF-β1與Neu的雙基因型(bigenic)的老鼠，也表現(xiàn)出比MMTV/Neu更多的循環(huán)中腫瘤細(xì)胞與肺部癌癥轉(zhuǎn)移。會(huì)表現(xiàn)Neu和具活性的TGF-β1之乳腺腫瘤細(xì)胞，能侵入Matrigel並且能在transwells上移動(dòng)，但卻受可溶性的TβRII:Fc給阻斷，表示單單Neu不足以誘導(dǎo)出一種侵略性的表現(xiàn)型。再者，在會(huì)表現(xiàn)具活性Neu的基因轉(zhuǎn)殖腫瘤裡，若共同表現(xiàn)具活性的突變種Alk5和TβRI，會(huì)增加肺部血管外的癌癥移轉(zhuǎn)(extravascular lung metastasis)，這與TGF-β之效應(yīng)相符：也就是腫瘤周圍蛋白酶、癌癥細(xì)胞的附著和侵略。PyVmT是一個(gè)強(qiáng)而有力的癌癥基因，我們也已經(jīng)知道它會(huì)活化ErK和PI3K；但2G7竟然能對(duì)如此的腫瘤細(xì)胞具備有效的抗腫瘤移轉(zhuǎn)效果，有點(diǎn)不符合直覺。但是，這表示TGF-β可以放大癌癥基因的訊號(hào)，而只要這訊號(hào)大於某一閾值，可以完全地使腫瘤移轉(zhuǎn)被觀察到；並且，相反地，在腫瘤基因已惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(oncogene-transformed cells)內(nèi)阻斷TGF-β訊號(hào)時(shí)，會(huì)把這些訊號(hào)降低至比閾值更低的程度，使其無法到達(dá)癌癥基因誘導(dǎo)癌癥進(jìn)行。確實(shí)如此，在鱗狀細(xì)胞癌(squamous cancers)中被逼著表現(xiàn)的顯性-具活性Smad2，已經(jīng)被證實(shí)會(huì)和有活性的Ras共同作用，使不具侵略性的腫瘤轉(zhuǎn)變成會(huì)轉(zhuǎn)移的腫瘤；但Smad突變型不與TβRI結(jié)合，並會(huì)抑制乳癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。最後，在Ras經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，顯性-不具活性且被截短的TβRI表現(xiàn)之後，則是會(huì)抑制腫瘤的產(chǎn)生能力(tumorigenicity)以及癌癥移轉(zhuǎn)。

        癌癥治療後的腫瘤再增殖(repopulation)與發(fā)展，是一眾所皆知的現(xiàn)象。它已被證實(shí)會(huì)在放射治療、化學(xué)治療以及手術(shù)摘除後發(fā)生。（在參考文獻(xiàn)37中有回顧）。TGF-β的濃度會(huì)對(duì)放射線有所反應(yīng)而增加，也被發(fā)現(xiàn)與放射治療後之肺臟受傷有關(guān)，這是由膠原蛋白沉積、肺泡壁的增厚以及內(nèi)皮細(xì)胞受傷所致。放射線引起的肺臟組織傷害，會(huì)因?yàn)槭┮钥?/span>TGF-β抗體而顯著地減少。在手術(shù)方面，已經(jīng)有人提出，因?yàn)榻M織操作以及傷口復(fù)原而產(chǎn)生的生長激素過量釋放，包括TGF-β的過量釋放，會(huì)緊接著手術(shù)之後促進(jìn)癌癥移轉(zhuǎn)。確實(shí)如此，手術(shù)之後，循環(huán)中隨即發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的存在，也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增加；而且在治療性切除直腸癌兩週之後，若循環(huán)中的TGF-β濃度居高不下，就表示癌癥會(huì)很快地轉(zhuǎn)移至肝臟。相反地，在手術(shù)剛切除直腸腫瘤後，血清中的TGF-β濃度卻是顯著地降低的。最後，以化學(xué)-放射治療處理後期的頭頸部癌癥，以及以化學(xué)治療處理非小型細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancers)的情形下，循環(huán)中的TGF-β濃度已被證實(shí)和對(duì)治療的反應(yīng)相關(guān)。

        在本研究中，我們展示了放射治療與化學(xué)治療會(huì)提升循環(huán)中的TGF-β濃度、循環(huán)中的癌癥細(xì)胞數(shù)、以及癌癥的移轉(zhuǎn)。這些效應(yīng)會(huì)因?yàn)橄到y(tǒng)性地施加2G7而被阻斷，因此支持TGF-β為癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)展之肇因的說法。這些數(shù)據(jù)有數(shù)個(gè)臨床上的含意。第一，因癌癥治療而增加的循環(huán)中TGF-β濃度，應(yīng)該要預(yù)前地探討與監(jiān)控，因?yàn)樗�可能是一種標(biāo)記，代表腫瘤注定要在治療之後快速地增長。第二，在循環(huán)中TGF-β濃度已被觀察到增加的病人，其身上帶有的腫瘤，可能會(huì)因我們施加TGF-β抑制劑而加強(qiáng)基本療程的效果，也可能可以抵銷與療程相關(guān)的毒性效應(yīng)，例如放射線引起的組織傷害以及纖維化。我們預(yù)期，以我們現(xiàn)存的方法以及尚在臨床研發(fā)中的治療用TGF-β抑制劑，這些假說在不久的將來可以被證實(shí)。

方法

        藥劑與細(xì)胞株。2G7融合瘤是B. Fendly (Genentech)所贈(zèng)。它是在Vanderbilt University Molecular Recognition Core facility被製出以及用親和純化法所得到的。重組的人類TGF-β1以及為TGF-β1用的Quantikine Elisa kit是從 R&D Systems取得。表現(xiàn)PyVmT的細(xì)胞株是從MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠的乳腺腫瘤中取得。PyVmT/TGFBR2^flox/flox 及PyVmT/TGFBR2^KO細(xì)胞株是分別從PyVmT/TGFBR2^flox/flox 及PyVmT/TGFBR2^KO老鼠的乳腺癌中取得。我們?cè)谶@些老鼠中使用Cre/Lox技術(shù)，有條件地從乳腺中刪除了TGF-βII。細(xì)胞被培養(yǎng)在一個(gè)37°C、濕化5%的溫箱中，並且培養(yǎng)於添加了10% FBS(HyClone)的DMEM(Cellgro; Mediatech Inc.)中。

        TGF-β1的生物檢測(cè)。貂肺臟內(nèi)皮報(bào)告細(xì)胞(mink lung epithelial reporter cell)在PAI-1啟動(dòng)子控制下，穩(wěn)定地表現(xiàn)螢火蟲luciferase。這些細(xì)胞接種於12-well 培養(yǎng)皿上 (2x10⁵/well)並且留置過夜供其貼附。已知濃度的可溶性TGF-β1或肺臟組織的細(xì)胞裂解液(250μg/well)加入了三次，而這些細(xì)胞被留在5%二氧化碳、37°C的環(huán)境下培養(yǎng)了另外24小時(shí)。在清洗之後，這些細(xì)胞被收取至200μg/well的裂解緩衝液中(Dual Luciferase Kit; Promega)，luciferase的活性則是在依據(jù)廠商提供的實(shí)驗(yàn)步驟下進(jìn)行了測(cè)量。

        DNA萃取與聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)。以石蠟固定的腫瘤切片被取出和重新添加水分。趁著還潮濕的時(shí)候，腫瘤部分以經(jīng)消毒之刀片刮取至經(jīng)消毒的eppendorf管中。DNA萃取是使用Instagene (Bio-Rad)並依廠商提供的實(shí)驗(yàn)步驟所完成。DNA樣本儲(chǔ)存在-20°C，除非要另外使用。Cre誘導(dǎo)的PyVmT/TGFBR2^KO腫瘤重組，是用PCR引子以及前述之反應(yīng)條件下所驗(yàn)證的。

        眼窩後(retroorbital)血液收集以及TGF-β1之定量。老鼠以1%-2% isofluorane麻醉。血液(約250μl/老鼠)採集於眼睛裡的結(jié)膜靜脈，作法是使用肝素化之Natelson tube (Fisher Scientific)然後再移轉(zhuǎn)到肝素化的(heparinized)玻璃管中。血漿的製備是使用Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences)並依照廠商之使用說明進(jìn)行，且增加了一個(gè)步驟，即在4°C下以10000g離心十分鐘以除去血小板。為測(cè)量PyVmT表現(xiàn)型細(xì)胞之培養(yǎng)基中的TGF-β1，1 x 10⁶ 的細(xì)胞被塗佈在含在完全培養(yǎng)基的10 mm盤上，並且供其貼附。該培養(yǎng)基在隔天被更換成無血清之培養(yǎng)基。隔夜培養(yǎng)後，細(xì)胞被施以1.25-7.5 Gy。過72小時(shí)後，培養(yǎng)基經(jīng)收集並以快速真空法濃縮(3 ml to 500μl)。老鼠的血漿和受細(xì)胞條件培養(yǎng)基（cell-conditioned medium），均在下一步的TGF-β1的Quantikine Elisa kit (R&D Systems)中接受測(cè)試，依照的是廠商提供的實(shí)驗(yàn)步驟。標(biāo)準(zhǔn)曲線以31.5–2,000 pg/ml的人類重組TGF-β1繪出後，被用來計(jì)算TGF-β在老鼠血漿與細(xì)胞培養(yǎng)基中的等量。每項(xiàng)標(biāo)本都在另外的重製實(shí)驗(yàn)中重複檢驗(yàn)了三次。

        TGF-β2之定量。依照廠商提供之實(shí)驗(yàn)步驟，在酸活化之後，血漿標(biāo)本以TGF-β2 Quantikine Elisa kit (R&D Systems)測(cè)試。標(biāo)準(zhǔn)曲線以31.5–2,000 pg/ml的人類重組TGF-β2繪出後，被用來計(jì)算TGF-β2在老鼠血漿的等量。每項(xiàng)標(biāo)本都在另外的重製實(shí)驗(yàn)中重複檢驗(yàn)了三次。

        老鼠的放射處理。MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖老鼠或正常的FVB母老鼠(Harlan)，在麻醉後把背部固定在鏡臺(tái)上。我們使用了單一的胸前輻射場(chǎng)，並使用了鉛塊掩護(hù)老鼠身體的其他部分。在某些實(shí)驗(yàn)中則是使用了一個(gè)單一腹部輻射場(chǎng)。老鼠被施加300 kVp 的X光，其劑量為 2.05 Gy/min。所有的老鼠都依照此法規(guī)Institutional Animal Care and Use Committee of Vanderbilt University Medical Center，被留在一個(gè)專門的無病原空間中。在動(dòng)物暴露在放射線或其他處理後，餵食正常食物，並且詳細(xì)觀察是否有任何情緒不穩(wěn)的跡象。

        小紅莓(doxorubicin)的處理。53天大的MMTV/PyVmT老鼠，經(jīng)腹腔注射三次溶解於食鹽水液中的doxorubicin (Adriamycin; 5 mg/kg; Sigma-Aldrich），每次間隔21天，直到第95天止。經(jīng)無效空白試劑或小紅莓處理之老鼠，其血液樣本和肺臟組織，都於第107天解剖取得。為了要檢查小紅莓處理之後的循環(huán)中腫瘤細(xì)胞，經(jīng)無效空白試劑或小紅莓處理之老鼠，其血液在取得24小時(shí)後，又加入了單一劑量(5 mg/kg)。

        偵測(cè)循環(huán)中腫瘤細(xì)胞。循環(huán)中腫瘤細(xì)胞之培養(yǎng)方法如前述，僅有少部分之修改。扼要地說，血液取得於心臟穿刺。細(xì)胞懸浮液（包括buffy coat以及紅血球）從血漿中分離出後，接種在6-well盤上，這些盤上佈有了生長激素減量之Matrigel (BD Biosciences)，並添加有DMEM、10%FBS，之後便於37°C、5%二氧化碳之溫箱中培養(yǎng)。隔天，在每個(gè)well使用了紅血球移除緩衝液(4.15 g NH4Cl, 0.5 g NaHCO3, 0.0186 g disodium EDTA in 200 ml water)以及PBS，數(shù)次緩和的沖洗。DMEM與10%FBS(3ml/well)添加後，新鮮的培養(yǎng)基每三天將會(huì)補(bǔ)充一次。過了10-12天後，以人工計(jì)數(shù)大小為50μm以上之細(xì)胞集落。PyVmT表現(xiàn)是用免疫細(xì)胞化學(xué)方法來偵測(cè)的。扼要地說，吸出培養(yǎng)基、以PBS清洗wells，然後細(xì)胞集落以10%中性緩衝的福馬林(formalin)，在室溫下固定30分鐘，再用PBS清洗2次，再於室溫下與PBS中之3%BSA共存1小時(shí)。培養(yǎng)盤接著培養(yǎng)隔夜，於4°C置放於含有生物素標(biāo)記的抗PyVmT的老鼠單株抗體(diluted 1:500, BIOT-115L; Covance)。然後，加入與streptavidin結(jié)合之螢光二級(jí)抗體(Oregon Green 488; Invitrogen) 室溫下1小時(shí)，之後使用Hoechst 細(xì)胞核染色法(1 μg/ml 十使用分鐘)。免疫螢光是以Leica DM IRB 倒置顯微鏡所觀察的。

        生產(chǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體以及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。MMTV/PyVmT細(xì)胞，是以luciferase之載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。一個(gè)luciferase cassette從pGL3-Basic (Promega)裁切下來，並嵌入pMSCV-puro (Clontech)之多重複製位上。amphotropic packaging Phoenix cells 轉(zhuǎn)染後，產(chǎn)生感染性病毒顆粒，如前述。培養(yǎng)生長中(subconfluent)之癌癥基因表現(xiàn)細(xì)胞，在4 μg/ml Polybrene (Sigma-Aldrich)中，以病毒上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí)，而含有病毒顆粒的培養(yǎng)基在6小時(shí)之後更換；在48小時(shí)後，再添加含有10%已經(jīng)加熱變性之FCS的DMEM，並於7-10天後將抗藥的細(xì)胞集落合併。

        腫瘤產(chǎn)生能力以及腫瘤轉(zhuǎn)移之研究。在1%–2% isofluorane 之麻醉下，MMTV/PyVmT/Luc 細(xì)胞(2 × 10⁶ cells in 200 μl PBS) 被注射於FVB母鼠的左側(cè)四號(hào)乳腺脂肪墊。扼要地說，在注入腫瘤細(xì)胞之前，脂肪墊便已經(jīng)以手術(shù)使其暴露在外，而傷口以乾淨(jìng)夾子密合，並於10天之後取走。每週以生物發(fā)光法檢查腫瘤兩次，並系列地以測(cè)徑器測(cè)量之。這些腫瘤的以立方公釐(mm³)計(jì)算之體積，是以此數(shù)學(xué)式計(jì)算：v = (w2 × l)/2，v代表體積，w代表寬度，l代表長度。當(dāng)腫瘤達(dá)到了200 mm³或更大的體積（約兩週時(shí)間），老鼠就被施以放射線處理，或是不作任何處理。老鼠繼續(xù)每週兩次接受生物發(fā)光法的監(jiān)控觀察，直到實(shí)驗(yàn)終結(jié)。兩週之後，將老鼠犧牲並取得基本的腫瘤與肺臟。以解剖顯微鏡計(jì)算肺臟表面之癌癥轉(zhuǎn)移數(shù)，之後這些肺臟以10%中性緩衝之福馬林(formalin)固定之。固定好的腫瘤切片，以H&E染色之，並以顯微鏡檢查是否有肺癌之轉(zhuǎn)移。血液是由心臟穿刺取得以如前述，測(cè)量TGF-β之濃度以及循環(huán)中之腫瘤細(xì)胞數(shù)。

        在其他的情形裡，我們使用了MMTV/PyVmT、PyVmT/TGFBR2^flox/flox或PyVmT/TGFBR2^KO細(xì)胞來表現(xiàn)luciferase。2.5 × 10⁶ 之單一細(xì)胞懸浮液製備後，重新溶於無菌之PBS液中。0.5 × 10⁶ (in 200 μl)的細(xì)胞被注射入FVB母鼠之側(cè)面尾部靜脈中。靜脈注射24小時(shí)後，腫瘤細(xì)胞於老鼠肺部之位置，以生物發(fā)光法確定之，並且自此之後每週追蹤兩次。為了要在活體內(nèi)阻斷TGF-β，在把10 Gy注入老鼠胸腔的前24小時(shí)，將15 mg/kg的2G7注入老鼠腹腔內(nèi)，每週兩次，持續(xù)進(jìn)行，直到老鼠死亡。

        生物發(fā)光法顯影技術(shù)。要將生物發(fā)光之訊號(hào)與腫瘤負(fù)載量建立定量的對(duì)應(yīng)關(guān)係，先以溶解於去離子水的 luciferin substrate (d-luciferin potassium salt; Promega)進(jìn)行腹腔注射(0.15 mg/g body weight)，在注射之後12分鐘內(nèi)取得影像。根據(jù)我們之前的時(shí)間記錄之實(shí)驗(yàn)，在此時(shí)間記錄訊號(hào)高峰處之強(qiáng)度（資料未呈現(xiàn)）。在取得影像時(shí)，將老鼠以isofluorane麻醉。生物發(fā)光顯影是以Vanderbilt University Small Animal Imaging Center的 IVIS-200 顯影系統(tǒng) (Xenogen)完成的。我們採用了3-5分鐘的整合計(jì)算時(shí)間，並使用on-chip binning of 8，以增加訊號(hào)-雜訊比。生物發(fā)光顯影之定量分析是以Living Image software (Xenogen)完成，我們?cè)诖硕�義了感興趣區(qū)域（regions of interest，ROI）並測(cè)量了integrated photon counts。

        統(tǒng)計(jì)。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以雙尾Student’s t test分析。P值小於0.05被視為顯著。

表一

穩(wěn)定表現(xiàn)luciferase的MMTV/PyVmT細(xì)胞，被注射入FVB老鼠的右側(cè)鼠蹊乳腺脂肪墊中。擁有200mm³以上腫瘤的老鼠，不加以放射處理，或是在胸腔施加10 Gy的放射處理。在24小時(shí)及2週後，以心臟穿刺取得血液，並測(cè)量細(xì)胞懸浮液在活體外形成細(xì)胞集落的能力，如「方法」文中所示。數(shù)據(jù)為兩個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)中，每組五隻老鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。RT是指放射治療（radiation therapy）。在同一時(shí)間點(diǎn)下，AP = 0.016 versus 0 Gy。

圖一

放射線與化學(xué)治療增加循環(huán)中TGF-β1濃度。 (A) 10 Gy 的放射線被施加於FVB老鼠之胸腔(thorax) (左)或骨盆腔(pelvis )(右)。24小時(shí)之後取得血液，血漿中之TGF-β1濃度以在「方法」中所述測(cè)量。(B) 八週大、帶有腫瘤之MMTV/PyVmT 老鼠，或非基因轉(zhuǎn)殖之FVB 老鼠，在四號(hào)乳腺脂肪墊帶有200mm³以上大小之腫瘤，不作任何處理或施加10 Gy 於胸腔。血漿中TGF-β1 濃度，24小時(shí)後測(cè)量之。(C) 在第八週起，每隔21天，以空白試劑或腹腔注射小紅莓 (5 mg/kg i.p.)，處理基因轉(zhuǎn)殖老鼠三次。血漿中TGF-β1濃度在第十五週測(cè)量之。A–C 之?dāng)?shù)據(jù)代表三個(gè)不同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組使用三個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。(D) FVB老鼠胸腔被施加10 Gy。五週後，取得經(jīng)放射線處理、控制組老鼠之肺臟，及其細(xì)胞裂解液(250 μg/ml)，加到含有貂肺上皮細(xì)胞的triplicate wells，這些細(xì)胞會(huì)穩(wěn)定地表現(xiàn)plasminogen activator inhibitor–1/luciferase reporter (PAI-1/luciferase reporter)。二十四小時(shí)後，測(cè)量luciferase之表現(xiàn)，方法如「方法」部分中所述。圖示：*表示P < 0.05， **表示P < 0.01， ***表示P < 0.001 相對(duì)於控制組。

圖二

放射線與化學(xué)治療增加循環(huán)中腫瘤細(xì)胞量以及肺部之腫瘤轉(zhuǎn)移。(A) MMTV/PyVmT母鼠在八週大時(shí)，接受胸腔放射線處理。在第十三週時(shí)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)終結(jié)，以心臟穿刺取得血液，並量取其細(xì)胞懸浮液在體外產(chǎn)生細(xì)胞集落之能力，如「方法」中所述。CTCs代表循環(huán)中腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells）。在下面為一些具有代表性的影像，是由血液中取得、循環(huán)中單一個(gè)腫瘤細(xì)胞形成的細(xì)胞集落�；�因轉(zhuǎn)殖成功的細(xì)胞集落，用PyVmT抗體和螢光之次級(jí)抗體處理，並以螢光顯微鏡觀察並估計(jì)之。(B) 與A 同樣之老鼠，在第十三週大時(shí)計(jì)算肺部表面癌癥之轉(zhuǎn)移數(shù)目。A和B中之?dāng)?shù)據(jù)是代表三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每組中有四隻老鼠。從控制組以及經(jīng)放射線處理之基因轉(zhuǎn)殖老鼠上，取得具代表性之 H&E 染色的肺部組織切片。這些切片是胸腔放射處理後五週所取得，如下方所示。黑色箭頭所指為肺部癌癥轉(zhuǎn)移。(C) 八週大、帶有腫瘤的 MMTV/PyVmT 基因轉(zhuǎn)殖老鼠，每隔21天以空白試劑或腹腔注射小紅莓(5 mg/kg i.p.)處理共三次。此實(shí)驗(yàn)於第十五週時(shí)終結(jié)，並計(jì)算肺部表面之癌癥轉(zhuǎn)移數(shù)量。具代表性之H&E染色肺部切片，其含有癌癥轉(zhuǎn)移部分的中心如右方圖示。原始放大倍率為100倍。*表示P < 0.05， **表示P < 0.01 ，相較於控制組。

圖三

胸腔放射線會(huì)增加殖入腫瘤至肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。(A) 穩(wěn)定表現(xiàn)luciferase的MMTV/PyVmT 細(xì)胞，被注入同源FVB老鼠之乳腺脂肪墊中。之後，兩週一次，以生物發(fā)光顯影法監(jiān)測(cè)腫瘤生長以及肺部癌癥轉(zhuǎn)移。圖示為一具代表性之老鼠，圖為細(xì)胞注入兩週之後所攝(B與C)。帶有至少200 mm³ PyVmT/Luc腫瘤的老鼠，以胸腔放射線(10 Gy)處理之或不施加任何處理。 (B) 肺部癌癥轉(zhuǎn)移在兩週之後定量。數(shù)據(jù)為每兩次實(shí)驗(yàn)中之一次，每組五隻老鼠之平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。**表示P < 0.01 相較於控制組 (C) 肺部與原發(fā)腫瘤之H&E 切片。原始放大倍率為100倍。

圖四

放射線的先行處理，會(huì)使移轉(zhuǎn)的肺癌細(xì)胞更能夠拓展在原本無腫瘤的老鼠身上。(A) MMTV/PyVmT 細(xì)胞，在加有不含血清之培養(yǎng)基之100-mm 培養(yǎng)皿裡，以1.25–7.5 Gy處理。受細(xì)胞所影響之培養(yǎng)基在72小時(shí)後進(jìn)行收集，並以如「方法」中所述之ELISA得知TGF-β1之濃度。(B) 穩(wěn)定表現(xiàn)luciferase之MMTV/PyVmT 細(xì)胞，由尾部靜脈注入未交配之FVB母鼠。在接受細(xì)胞注射1小時(shí)之前，老鼠在圖中所標(biāo)部分之胸部，以10 Gy處理之。在注射之後2週，肺部之癌癥細(xì)胞以老鼠的生物發(fā)光法進(jìn)行視覺觀察（頂圖）。某些情形中，肺臟在添加d-luciferin之後被手術(shù)移除，並於體外進(jìn)行顯影（底圖）。控制組如左圖所示，受放射線處理之老鼠如右圖所示。(C) 具代表性的整體肺部載片（頂圖）以及控制組與放射線處理組之H&E肺部切片(底圖；原放大倍率為100)。(D) 在控制組與放射線處理老鼠中，肺部表面癌癥轉(zhuǎn)移之定量（左圖）與肺部重量（右圖）。數(shù)據(jù)為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組的五隻老鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖示：**表示P < 0.01， ***表示P < 0.001 ，相較於控制組。

圖五

TGF-β中和抗體2G7，阻斷了放射線誘導(dǎo)增加的肺部癌癥轉(zhuǎn)移。(A和B) 八週大、 帶有腫瘤的MMTV/PyVmT老鼠於胸腔接受10 Gy處理。在圖中標(biāo)出之部分，老鼠被每週兩次施以15 mg/kg 的2G7，直到第十三週。此時(shí)進(jìn)行肺部表面之癌癥轉(zhuǎn)移計(jì)數(shù)。(A) 數(shù)據(jù)為每組中五隻老鼠的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。(B) 代表性的H&E 染色肺部切片。此實(shí)驗(yàn)重複一次取得了類似的結(jié)果。(C) 當(dāng)實(shí)驗(yàn)終結(jié)，以心臟穿刺取得血液，並量取其細(xì)胞懸浮液在體外產(chǎn)生細(xì)胞集落之能力，如「方法」部分中所述。(D) 在第十三週，經(jīng)過胸腔放射處理、帶有腫瘤的基因轉(zhuǎn)殖鼠，收集血液。細(xì)胞懸浮液如C圖中情形，在20 μg/ml 2G7或PBS環(huán)境下，塗佈於培養(yǎng)盤上。10-12天後，人工計(jì)數(shù)等於或大於50 μm的細(xì)胞集落。數(shù)據(jù)為每組五隻老鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*表示P < 0.05， **表示P < 0.01 相較於控制組。

圖六

腫瘤細(xì)胞中不存在TGFβRII，能抵銷受放射線誘發(fā)的肺部癌癥轉(zhuǎn)移之增加。(A–C) 未交配的、八週大的FVB母鼠，從尾部靜脈注入穩(wěn)定表現(xiàn) luciferase的PyVmT/TGFBR2^flox/flox 與 PyVmT/TGFBR2^KO 細(xì)胞。這些老鼠在注射腫瘤細(xì)胞之前，一組接受、一組未接受胸腔的10 Gy處理。兩週後，以生物發(fā)光(A)、組織染色(B)、以及人工計(jì)數(shù)肺部表面癌癥轉(zhuǎn)移(C)的方法，來測(cè)定肺部表面癌癥轉(zhuǎn)移，如「方法」中所述。資料為每組中四隻老鼠的平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差。 (D) 兩組細(xì)胞株的基因體DNA之PCR結(jié)果，顯示重組片段的僅存在於PyVmT/TGFBR2^KO 細(xì)胞中。**表示P < 0.01 相較於控制組。

譯者：Jeffrey Chu at Hsinchu, Taiwan. 2009/4/4

期刊： 臨床研究期刊 (The Journal of Clinical Investigation) Volume 117 Number 5 May 2007 標(biāo)題： 以中和抗體抑制腫瘤成長因子 β 可避免因放射治療引起的腫瘤加速轉(zhuǎn)移 (Inhibition of TGF-β with neutralizing antibodies prevents radiation-induced acceleration of metastatic cancer progression) 作者 Swati Biswas,1 Marta Guix,2 Cammie Rinehart,2 Teresa C. Dugger,2 Anna Chytil,1 Harold L. Moses,1,3,4 Michael L. Freeman,5 and Carlos L. Arteaga1,2,4 單位 屬於美國田納西州 那什維爾 范德堡大學(xué)(Vanderbilt University) 1.癌癥生物學(xué)系、2.醫(yī)學(xué)系、3.病理學(xué)系、4. Vanderbilt-Ingram 癌癥中心乳癌研究計(jì)畫 以及 5. 放射腫瘤學(xué)系 摘要 我們探究了因癌癥治療而產(chǎn)生的 TGF-β 究竟會(huì)不會(huì)加速腫瘤的發(fā)生。我們使用了 MMTV/PyVmT 此一轉(zhuǎn)移型乳癌基因的轉(zhuǎn)殖模型，指出了游離輻射（譯註 1）或 doxorubicin （譯註 2）都會(huì)增加循環(huán)中 TGF-β1 與腫瘤細(xì)胞的量，並會(huì)增加肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。這些效應(yīng) 都因?yàn)槲覀兪褂昧朔?TGF-β 抗體而受抵銷。我們?cè)谟?TGF-β 抗體的環(huán)境下，體外培養(yǎng)了這 些在循環(huán)中會(huì)表現(xiàn)多瘤病毒中等 T 抗原（譯註 3）的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們不會(huì)生長；這表示 TGF-β 在這些細(xì)胞中是一種生存的訊號(hào)。當(dāng)老鼠的腫瘤不含有第二型 TGF-β 受器時(shí)，放射 線就不會(huì)增加肺部的癌癥轉(zhuǎn)移；這顯示至少在部分上，肺癌轉(zhuǎn)移是跟 TGF-β 在腫瘤細(xì)胞上 的直接作用有關(guān)的。這些數(shù)據(jù)含示，癌癥治療所產(chǎn)生的 TGF-β 是一種幫助癌癥轉(zhuǎn)移的訊號(hào)， 也提供了一個(gè)原理根據(jù)，讓我們得在癌癥治療時(shí)同時(shí)使用 TGF-β 抑制劑。 譯註 1：此為放射性治療。 譯註 2：此為一癌癥化學(xué)治療常用藥物，俗稱「小紅莓」。 譯註 3：此為感染此病毒之初期的產(chǎn)生的三種 T 抗原中其中一種。 介紹 腫瘤成長因子TGF-β，既是一個(gè)腫瘤抑制基因，也是一個(gè)腫瘤啟動(dòng)子。當(dāng)TGF-β配體 (ligands)結(jié)合到與其對(duì)應(yīng)的絲胺酸/酥胺酸(Ser/Thr)激酶跨胞膜受器後，這些受器接著就會(huì)磷 酸化、活化Smad族的訊息傳遞者。被活化之後，Smad 2、Smad 3 會(huì)與 Smad 4 結(jié)合並遷移 至細(xì)胞核內(nèi)，在此處調(diào)控與細(xì)胞週期停止(cell cycle arrest)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)相關(guān)的基因 之轉(zhuǎn)錄。TGF-β之所以有腫瘤抑制基因之用，即係此項(xiàng)調(diào)控之功。的確，在內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì) 中的TGF-β訊息傳遞，若是喪失或減弱，都會(huì)讓內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化(transformation)大 行其道。另一方面，已有研究顯示，若將顯性且無效的TGF-β受器引入至移轉(zhuǎn)的癌癥細(xì)胞中， 從上皮細(xì)胞型態(tài)轉(zhuǎn)變成間葉細(xì)胞型態(tài)的轉(zhuǎn)分化 (epithelial-to-mesenchymal transdifferentiation)、能動(dòng)性(motility)、侵略性(invasiveness)、以及存活率(survival)均會(huì)受到 抑制。這證明在已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，TGF-β扮演了一個(gè)腫瘤啟動(dòng)子的角色（於參考文獻(xiàn) 4中有回顧）。大部分的癌都保有TGF-β受器，卻喪失或部分喪失了Smad依賴性的抗細(xì)胞分 裂效應(yīng)(Smad-dependent antimitogenic effect)；同時(shí)，在某些個(gè)案中，他們還會(huì)對(duì)TGF-β有所 反應(yīng)，而獲得了幫助癌癥轉(zhuǎn)移的能力。進(jìn)而，不論癌癥細(xì)胞過度生產(chǎn)TGF-β、過度活化 TGF-β，或是兩者兼?zhèn)�，都�?huì)藉由旁泌(paracrine)的方式，改變腫瘤周圍的微小環(huán)境 (microenvironment)，幫助腫瘤的發(fā)生。這些資料提供了支持根據(jù)，讓我們得以設(shè)法阻斷人 類癌癥中的自泌性(autocrine)或旁泌性(paracrine)之TGF-β訊息傳遞，以達(dá)治療之目的。 除 Smad 族的蛋白質(zhì)外，TGF-β 還可以刺激數(shù)種轉(zhuǎn)化的訊息傳遞路徑。之前 TGF-β 已 被證實(shí)可保護(hù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞(transformed cells)不受細(xì)胞凋亡之害。此類細(xì)胞反應(yīng)有一種可能的機(jī) 制，就是 TGF-β 誘發(fā)了 PI3K 和 PI3K 的標(biāo)的物，也就是絲胺酸/酥胺酸激酶 Akt，此訊息傳 遞程序和對(duì)於癌癥藥物的抗藥性是相關(guān)連的。有些對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)療法有抗藥性的腫瘤會(huì)過度 表現(xiàn) TGF-β，而 TGF-β 的抑制劑經(jīng)證明可逆轉(zhuǎn)此種抗藥性。還有，大部分的腫瘤都會(huì)過度 表現(xiàn) TGF-β 配體(ligands)。在腫瘤組織與在血清中的高量 TGF-β 配體，與腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)、 患者較差的癒後，均有所相關(guān)。 在乳癌的基因轉(zhuǎn)殖模型中，TGF-β 之訊息傳遞可加強(qiáng)轉(zhuǎn)移既存的乳腺腫瘤。這是受例 如 Neu/ErbB2 或多腺瘤病毒中央Ｔ抗原(polyomavirus middle T antigen, PyVmT)等的癌癥基 因之誘發(fā)所致。再者，在 MMTV/LTR 乳腺啟動(dòng)子的控制下，表現(xiàn) PyVmT 癌癥基因的基因 轉(zhuǎn)殖鼠，經(jīng)過有條件的 TGF-β1 誘導(dǎo)，只要兩個(gè)禮拜之短，轉(zhuǎn)移肺癌的機(jī)率便高了十倍。有 些癌癥治療已被證實(shí)會(huì)全面性地、或留在原處誘發(fā) TGF-β。所以我們推測(cè)，被癌癥治療所 誘發(fā)的 TGF-β，會(huì)提供存活訊息給這些對(duì)化療有抗藥性的腫瘤裡的細(xì)胞，或者一部分此種 腫瘤中的細(xì)胞，使它們可能在治療之後，立即加速腫瘤的擴(kuò)展。在此，我們使用了乳癌轉(zhuǎn) 移 的 MMTV/PyVmT 基因轉(zhuǎn)殖模型來展示，游離輻射 (ionizing radiation) 和 小紅莓 (doxorubicin)提高了循環(huán)中的 TGF-β1 濃度、循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞數(shù)、以及肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。 這些效應(yīng)都藉由 TGF-β 中和抗體的施加，而得以抵銷。在缺乏第二型 TGF-β 受器(TβRII)的 老鼠身上，放射線則沒有增加肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。這些資料暗示，癌癥治療所產(chǎn)生的 TGF-β 是腫瘤中一個(gè)幫助癌癥轉(zhuǎn)移的訊號(hào)，因此也提供了原理根據(jù)，使我們?cè)谑褂眠@些療法時(shí)， 得以同時(shí)搭配使用 TGF-β 的抑制劑。 結(jié)果 胸腔放射線處理與化學(xué)治療提高了循環(huán)中的 TGF-β 量。我們?cè)诎诉L大的未交配母鼠之 胸腔與骨盆內(nèi)，施加了 10 Gy 的放射線。在施加放射線之後隔 24 小時(shí)，進(jìn)行血液採集。我 們?cè)谑芊派涮幚碇�老鼠的血漿裡，觀察到約為控制組 2 倍的 TGF-β1 含量 （胸腔，P=0.03； 骨盆，P=0.02；圖一 A）；同時(shí)，TGF-β2 的量沒有改變（資料未呈現(xiàn)）。在八週大的 MMTV/PyVmT 基因轉(zhuǎn)殖鼠中，或是在種下 MMTV/PyVmT 腫瘤細(xì)胞、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了 luciferase 表現(xiàn)載體的非基因轉(zhuǎn)殖鼠中，我們都得到類似的結(jié)果（分別為 P=0.015 與 P=0.007，相較於控制組，圖一 B）。在經(jīng)過放射處理後，TGF-β1 的濃度有持續(xù)七天比控制 組高（資料未呈現(xiàn)）。為了將這些結(jié)果推廣到其他的癌癥治療法，我們測(cè)試了 DNA 嵌入劑 (DNA-intercalating agent)與 topoisomerase II 之抑制劑 doxorubicin（Adriamycin）的效果如 何。從第八週開始，基因轉(zhuǎn)殖鼠被施行三次腹腔注射 doxorubicin (5 mg/kg i.p.)，每次分別間 隔 21 天。在第十五週收集到的血漿裡發(fā)現(xiàn)，相較於未處理的老鼠，TGF-β1 濃度提高了兩 倍(P = 0.009；圖一 C)，而 TGF-β2 濃度則是持平不變。為了要測(cè)量在放射處理後五週所取 得的肺臟組織中，被活化的 TGF-β1 之濃度，我們使用了一種 TGF-β1 生物檢驗(yàn)來檢測(cè)，這 檢 測(cè) 是使用一種會(huì) 穩(wěn)定表現(xiàn) plasminogen activator inhibitor-1/luciferase reporter (PAI-1/luciferase reporter) 的貂肺內(nèi)皮細(xì)胞來運(yùn)作的。相較於未受放射處理之老鼠肺組織裂 解液，經(jīng)過放射線處理的老鼠肺組織裂解液，誘導(dǎo)提升了有 2 倍多的 TGF-β1 濃度 （P=0.0008；圖一 D）。 胸腔的放射線處理及化學(xué)治療，會(huì)增加循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞量與增加肺部癌癥轉(zhuǎn)移。 TGF-β增強(qiáng)了會(huì)表現(xiàn)PyVmT腫瘤基因之腫瘤細(xì)胞的存活率，而且之前已被證實(shí)，TGF-β有條 件地被誘發(fā)後，會(huì)在MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠中加速乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，我們推測(cè)， 因治療而提升的循環(huán)中TGF-β1濃度，可能和這個(gè)乳癌轉(zhuǎn)移模型中的循環(huán)中腫瘤細(xì)胞增加、 肺部癌癥轉(zhuǎn)移增加，有所關(guān)連。帶有腫瘤的MMTV/PyVmT老鼠在第八週大時(shí)，被施行胸腔 放射處理(thoracic irradiation)(10 Gy)直至第十三週為止。實(shí)驗(yàn)終結(jié)時(shí)進(jìn)行心臟穿刺以取得血 液，而血液中的細(xì)胞部分，則拿去測(cè)試其在活體外生成細(xì)胞集落之能力。從未經(jīng)放射處理 之老鼠所取得之血液，產(chǎn)生了平均1.6 ± 1.5個(gè)細(xì)胞集落；而從經(jīng)過放射處理之老鼠所取得之 血液，於10-12天後所測(cè)量的結(jié)果是，產(chǎn)生了平均28.3 ± 7.6個(gè)細(xì)胞集落（P=0.02：圖二A）。 PyVmT抗體的免疫染色證實(shí)，這些生長的細(xì)胞集落有表現(xiàn)癌癥基因（圖二A）。循環(huán)中的活 腫瘤細(xì)胞數(shù)有所增加；而和此相符合的是，我們?cè)诮?jīng)放射處理的老鼠中，觀察到較未經(jīng)處 理之控制組17倍的肺部表面癌癥轉(zhuǎn)移（P = 0.009；圖二B）。在被用doxorubicin處理相較於未 處理之老鼠中，也在肺部癌癥轉(zhuǎn)移觀察到類似的上升情形（P = 0.032；圖二C）。在施加 doxorubicin 24小時(shí)之後，相較於未經(jīng)處理之控制組老鼠所取得之血液，也觀察到在細(xì)胞群 落數(shù)目的上升（17.2 ± 3.7與7.2 ± 2 colonies; n = 5; P = 0.007)。從老鼠的體重及一系列的腫瘤 直徑數(shù)據(jù)來看，受處理與未處理的老鼠在腫瘤負(fù)荷量上並無差異，這表示TGF-β1濃度之差 別，不能簡(jiǎn)單地以腫瘤負(fù)荷量會(huì)隨時(shí)間增加來解釋。 接下來，我們檢驗(yàn)了放射線所誘發(fā)之肺部癌癥轉(zhuǎn)移，是否僅限於帶有腫瘤的 MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠身上。為了測(cè)試這個(gè)可能性，我們從會(huì)表現(xiàn)PyVmT之基因轉(zhuǎn)殖的 乳腺癌中，取得表現(xiàn)luciferase的腫瘤細(xì)胞，然後將其注射至非基因轉(zhuǎn)殖的同源FVB老鼠身 上。這些老鼠中的腫瘤，生長在左側(cè)鼠蹊(inguinal)（四號(hào)）的乳腺脂肪墊，我們以生物發(fā)光 法，觀察並估計(jì)了其轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至肺臟的情形（圖三A）。當(dāng)腫瘤長到了200mm3 或更大時(shí)，老 鼠在胸腔施加了10 Gy 的放射線並在其餘部分施加屏障，兩週後將老鼠犧牲。相較於控制 組，接受放射處理的老鼠增加了三倍的表面肺部癌癥轉(zhuǎn)移(P = 0.005; 圖三，B和C)。再者， 在放射處理後24小時(shí)與兩週之後，分別有相較於控制組多8倍與5倍的循環(huán)中腫瘤細(xì)胞量（表 一）。在實(shí)驗(yàn)組與控制組間，原發(fā)腫瘤的生長率並無不同（資料未呈現(xiàn)）。 將培養(yǎng)中的PyVmT細(xì)胞暴露在1.25 - 7.50 Gy下，會(huì)增加其產(chǎn)生TGF-β的量（圖四A）。在 以上所述之研究過程中，有既成之腫瘤的老鼠才會(huì)施加放射線處理；循環(huán)中TGF-β濃度的增 加，有可能是因?yàn)榉派渚�在癌癥細(xì)胞上的作用，因此我們想排除掉這個(gè)可能。我們對(duì)未交 配的FVB母鼠施加了10 Gy的胸腔放射。在放射處理後一個(gè)小時(shí)，我們從尾部靜脈注入了表 現(xiàn) PyVmT 且受 luciferase 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stably transfected)的腫瘤細(xì)胞。肺臟中的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷 量(tumor cell burden)，是在腫瘤細(xì)胞的注入之後，使用活體內(nèi)(in vivo)與活體外(ex vivo)的生 物發(fā)光來監(jiān)測(cè)的。經(jīng)放射線處理的老鼠肺臟，表現(xiàn)了較控制組為高的生物發(fā)光訊號(hào)（圖四 B），此訊號(hào)與人工計(jì)數(shù)之表面肺癌轉(zhuǎn)移數(shù)量是相關(guān)連的，亦與肺臟重量相關(guān)（圖四，C與D）。 TGF-β中和抗體阻斷了受放射線誘導(dǎo)增加之肺部癌癥轉(zhuǎn)移。我們使用了2G7中和泛 TGF-β IgG2抗體 (2G7 neutralizing pan-TGF-β IgG2)來驗(yàn)證，放射線所誘導(dǎo)增加的循環(huán)中 TGF-β濃度，是否在肺癌轉(zhuǎn)移中扮演一個(gè)成因的角色。這個(gè)單株抗體阻斷了所有三種哺乳類 所具有的TGF-β異構(gòu)物，並且在活體中有活性。八週大的MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠，在胸 腔放射處理的2小時(shí)之前，以15mg/kg 之2G7或PBS注射至腹腔中。這些處理持續(xù)每週兩次， 到第十三週為止，此時(shí)將老鼠犧牲並測(cè)量是否肺部有癌癥轉(zhuǎn)移。然而有趣的是，施打2G7 到未經(jīng)放射線處理的老鼠中，少許增加了肺癌轉(zhuǎn)移，但在統(tǒng)計(jì)上並不顯著（圖五A和B）。在 兩種實(shí)驗(yàn)組別之間，並未存在原發(fā)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷量的差異（資料未呈現(xiàn)）。 我們收集了血液並體外培養(yǎng)其細(xì)胞懸浮液，以估計(jì)在循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞量。從未經(jīng)放 射處理與經(jīng)過放射處理的老鼠身上，血液中取得而培養(yǎng)的細(xì)胞群落數(shù)，均因施加2G7而顯著 地減少（圖五C）。最後，我們檢驗(yàn)了在體外添加2G7以抑制TGF-β，是否會(huì)阻止老鼠血液中 取得之腫瘤細(xì)胞群落生長。將帶有腫瘤、經(jīng)過放射處理的老鼠所取得之血液，接種於含有 2G7與不含有2G7的環(huán)境下，而在十天之後評(píng)估其集落生長情形。將細(xì)胞培養(yǎng)在存有2G7的 環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)會(huì)降低70%的細(xì)胞群落數(shù)（圖五D），這表示自泌性的(autocrine) TGF-β對(duì)於表 現(xiàn)PyVmT的循環(huán)中癌癥細(xì)胞，是一種存活因子。 放射線誘導(dǎo)增加肺部癌癥轉(zhuǎn)移，需要腫瘤細(xì)胞內(nèi)的TGF-β受器。以上描述的結(jié)果顯示， 因放射線誘導(dǎo)之循環(huán)中TGF-β濃度提升，是對(duì)於循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的存活信號(hào)，讓細(xì)胞可以移 居至肺臟、在肺臟裡生長。因此我們推論，藉由移除細(xì)胞對(duì)循環(huán)中TGF-β的反應(yīng)，以使得TβRII 不存在於MMTV/PyVmT腫瘤中，就可以抵銷放射處理在癌癥轉(zhuǎn)移上的效應(yīng)。為檢驗(yàn)此推論 之可能，我們使用了表現(xiàn)PyVmT的腫瘤細(xì)胞，並且用Cre-Lox技術(shù)將TβRII有條件地於細(xì)胞 中移除 。含有或未含 TGFBR2 的 PyVmT 表現(xiàn)型腫瘤細(xì)胞株（在此之後將稱為 PyVmT/TGFBR2flox/flox or PyVmT/TGFBR2KO ） 是分別從 PyVmT/TGFBR2flox/flox 及 PyVmT/TGFBR2KO老鼠身上的乳腺癌所產(chǎn)生。PyVmT/TGFBR2flox/flox 及PyVmT/TGFBR2KO 細(xì)胞株均以luciferase之載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，且經(jīng)由尾部靜脈注射入八週大、未交配的FVB母鼠， 這些母鼠有些沒有經(jīng)過放射線處理，有些則是在注射腫瘤細(xì)胞之前1小時(shí)，施加了10 Gy的 胸腔放射。兩週後估計(jì)肺部癌癥轉(zhuǎn)移情形。在被注射PyVmT/TGFBR2flox/flox 細(xì)胞的老鼠裡， 經(jīng)放射處理之老鼠相較於控制組老鼠，發(fā)現(xiàn)生物發(fā)光訊號(hào)有所增加、肺部癌癥轉(zhuǎn)移增加6 倍；但如果老鼠之前是被注射不含有TβRII的細(xì)胞，在施加與未施加放射處理的兩組中，便 沒有差別（圖六，A-C）。PyVmT/TGFBR2KO 的腫瘤結(jié)節(jié)比 PyVmT/TGFBR2flox/flox 的腫瘤 結(jié)節(jié)還大，此結(jié)果與之前的一項(xiàng)報(bào)告是相符合的，也就是說，PyVmT表現(xiàn)型乳癌細(xì)胞之TβRII 喪失，會(huì)增進(jìn)肺部癌癥轉(zhuǎn)移的生長。經(jīng)PCR擴(kuò)增腫瘤組織中取得之DNA證實(shí)了在 PyVmT/TGFBR2KO細(xì)胞中，是存在基因重組的（圖六D）。 討論 我們?cè)诨�因轉(zhuǎn)殖老鼠的乳癌轉(zhuǎn)移模型中，研究了癌癥治療所誘發(fā)的TGF-β是否會(huì)加速腫 瘤的發(fā)生。在MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠中，在肺部施加游離輻射或是以doxorubicin處理， 都增加了循環(huán)中的TGF-β1量、循環(huán)中腫瘤細(xì)胞數(shù)以及肺部癌癥轉(zhuǎn)移。循環(huán)中TGF-β1濃度增 加、之後的癌癥轉(zhuǎn)移增加，並不需要老鼠在施加處理時(shí)就擁有腫瘤，就如同我們也在放射 處理後才施打腫瘤細(xì)胞的老鼠中所觀察到的。TGF-β1會(huì)增加，並不僅限於受到胸腔放射處 理的誘導(dǎo)，因?yàn)槲覀冊(cè)诠桥璧姆派涮幚怼⒁约叭�面性施加doxorubicin下，也都觀察到了 TGF-β1的受誘導(dǎo)增加。在放射處理後，循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的增加以及腫瘤轉(zhuǎn)移的增加，都因 到2G7的施加而抵銷。重要的是，循環(huán)中PyVmT表現(xiàn)型腫瘤細(xì)胞無法在有2G7的環(huán)境下進(jìn)行 體外培養(yǎng)，這也就表示了自泌性(autocrine)TGF-β對(duì)這些細(xì)胞是一種存活的訊號(hào)。這些結(jié)果 與之前兩項(xiàng)研究是相吻合的；在這些研究中，以可溶性TβRII:Fc融合蛋白、或用反義 TGF-β1(antisense TGF-β1)穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染加以阻斷TGF-β，都抑制了腫瘤細(xì)胞的能動(dòng)性、存活 率、滲入(intravasation)以及肺部癌癥轉(zhuǎn)移。 老鼠身上的腫瘤不含TβRII，放射線便無法在這些老鼠身上加強(qiáng)肺部癌癥轉(zhuǎn)移。為了展 示此點(diǎn)，我們從PyVmT/TGFBR2flox/flox 與 PyVmT/TGFBR2KO之老鼠身上既成之乳腺腫瘤， 取得細(xì)胞株來使用。Forrester等人曾經(jīng)提出報(bào)告，以MMTV/Cre表現(xiàn)有條件地使TGFBR2缺 失時(shí)，這些knockout PyVmT表現(xiàn)型的腫瘤發(fā)生潛伏期就變短了許多，並且表現(xiàn)出明顯增加 的肺部癌癥轉(zhuǎn)移，這是相較於PyVmT/TGFBR2flox/flox型的腫瘤。因?yàn)槲覀兪褂昧遂o脈注射 法，並且，我們所注入細(xì)胞株是從既成之含有TβRII與未含TβRII的腫瘤而來，所以我們的結(jié) 果無法解釋Forrester等人所報(bào)導(dǎo)之癌癥潛伏與轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)。儘管我們?cè)诮?jīng)放射處理的老鼠中 無法排除TGF-β之增加，是否會(huì)影響宿主的微環(huán)境(microenvironment)與/或免疫系統(tǒng)，並進(jìn) 而幫助了腫瘤轉(zhuǎn)移之進(jìn)行，我們不含有TβRII之腫瘤的結(jié)果卻強(qiáng)烈地顯示，癌癥轉(zhuǎn)移之增加 至少在部分上，是肇因於TGF-β在癌癥細(xì)胞的直接作用。 在腫瘤細(xì)胞中，這些潛在受循環(huán)中TGF-β濃度調(diào)控的訊號(hào)反應(yīng)，目前仍屬未明。然而， TGF-β的助癌轉(zhuǎn)移效應(yīng)並不僅限於此基因轉(zhuǎn)殖模型。舉例說明，在MMTV/LTR啟動(dòng)子控制下 表現(xiàn)有活性的TGF-β1與Neu的雙基因型(bigenic)的老鼠，也表現(xiàn)出比MMTV/Neu更多的循環(huán) 中腫瘤細(xì)胞與肺部癌癥轉(zhuǎn)移。會(huì)表現(xiàn)Neu和具活性的TGF-β1之乳腺腫瘤細(xì)胞，能侵入Matrigel 並且能在transwells上移動(dòng)，但卻受可溶性的TβRII:Fc給阻斷，表示單單Neu不足以誘導(dǎo)出一 種侵略性的表現(xiàn)型。再者，在會(huì)表現(xiàn)具活性Neu的基因轉(zhuǎn)殖腫瘤裡，若共同表現(xiàn)具活性的突 變種Alk5和TβRI，會(huì)增加肺部血管外的癌癥移轉(zhuǎn)(extravascular lung metastasis)，這與TGF-β 之效應(yīng)相符：也就是腫瘤周圍蛋白酶、癌癥細(xì)胞的附著和侵略。PyVmT是一個(gè)強(qiáng)而有力的 癌癥基因，我們也已經(jīng)知道它會(huì)活化ErK和PI3K；但2G7竟然能對(duì)如此的腫瘤細(xì)胞具備有效 的抗腫瘤移轉(zhuǎn)效果，有點(diǎn)不符合直覺。但是，這表示TGF-β可以放大癌癥基因的訊號(hào)，而只 要這訊號(hào)大於某一閾值，可以完全地使腫瘤移轉(zhuǎn)被觀察到；並且，相反地，在腫瘤基因已 惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(oncogene-transformed cells)內(nèi)阻斷TGF-β訊號(hào)時(shí)，會(huì)把這些訊號(hào)降低至比閾 值更低的程度，使其無法到達(dá)癌癥基因誘導(dǎo)癌癥進(jìn)行。確實(shí)如此，在鱗狀細(xì)胞癌(squamous cancers)中被逼著表現(xiàn)的顯性-具活性Smad2，已經(jīng)被證實(shí)會(huì)和有活性的Ras共同作用，使不具 侵略性的腫瘤轉(zhuǎn)變成會(huì)轉(zhuǎn)移的腫瘤；但Smad突變型不與TβRI結(jié)合，並會(huì)抑制乳癌細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移。最後，在Ras經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，顯性-不具活性且被截短的TβRI表現(xiàn)之後，則是會(huì)抑 制腫瘤的產(chǎn)生能力(tumorigenicity)以及癌癥移轉(zhuǎn)。 癌癥治療後的腫瘤再增殖(repopulation)與發(fā)展，是一眾所皆知的現(xiàn)象。它已被證實(shí)會(huì)在 放射治療、化學(xué)治療以及手術(shù)摘除後發(fā)生。（在參考文獻(xiàn)37中有回顧）。TGF-β的濃度會(huì)對(duì)放 射線有所反應(yīng)而增加，也被發(fā)現(xiàn)與放射治療後之肺臟受傷有關(guān)，這是由膠原蛋白沉積、肺 泡壁的增厚以及內(nèi)皮細(xì)胞受傷所致。放射線引起的肺臟組織傷害，會(huì)因?yàn)槭┮钥筎GF-β抗體 而顯著地減少。在手術(shù)方面，已經(jīng)有人提出，因?yàn)榻M織操作以及傷口復(fù)原而產(chǎn)生的生長激 素過量釋放，包括TGF-β的過量釋放，會(huì)緊接著手術(shù)之後促進(jìn)癌癥移轉(zhuǎn)。確實(shí)如此，手術(shù)之 後，循環(huán)中隨即發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的存在，也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增加；而且在治療性切除 直腸癌兩週之後，若循環(huán)中的TGF-β濃度居高不下，就表示癌癥會(huì)很快地轉(zhuǎn)移至肝臟。相反 地，在手術(shù)剛切除直腸腫瘤後，血清中的TGF-β濃度卻是顯著地降低的。最後，以化學(xué)-放 射治療處理後期的頭頸部癌癥，以及以化學(xué)治療處理非小型細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancers)的情形下，循環(huán)中的TGF-β濃度已被證實(shí)和對(duì)治療的反應(yīng)相關(guān)。 在本研究中，我們展示了放射治療與化學(xué)治療會(huì)提升循環(huán)中的TGF-β濃度、循環(huán)中的癌 癥細(xì)胞數(shù)、以及癌癥的移轉(zhuǎn)。這些效應(yīng)會(huì)因?yàn)橄到y(tǒng)性地施加2G7而被阻斷，因此支持TGF-β 為癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)展之肇因的說法。這些數(shù)據(jù)有數(shù)個(gè)臨床上的含意。第一，因癌癥治療而增加 的循環(huán)中TGF-β濃度，應(yīng)該要預(yù)前地探討與監(jiān)控，因?yàn)樗�可能是一種標(biāo)記，代表腫瘤注定要 在治療之後快速地增長。第二，在循環(huán)中TGF-β濃度已被觀察到增加的病人，其身上帶有的 腫瘤，可能會(huì)因我們施加TGF-β抑制劑而加強(qiáng)基本療程的效果，也可能可以抵銷與療程相關(guān) 的毒性效應(yīng)，例如放射線引起的組織傷害以及纖維化。我們預(yù)期，以我們現(xiàn)存的方法以及 尚在臨床研發(fā)中的治療用TGF-β抑制劑，這些假說在不久的將來可以被證實(shí)。 方法 藥劑與細(xì)胞株。2G7融合瘤是B. Fendly (Genentech)所贈(zèng)。它是在Vanderbilt University Molecular Recognition Core facility被製出以及用親和純化法所得到的。重組的人類TGF-β1 以及為TGF-β1用的Quantikine Elisa kit是從 R&D Systems取得。表現(xiàn)PyVmT的細(xì)胞株是從 MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖鼠的乳腺腫瘤中取得。PyVmT/TGFBR2flox/flox 及PyVmT/TGFBR2KO 細(xì)胞株是分別從PyVmT/TGFBR2flox/flox 及PyVmT/TGFBR2KO老鼠的乳腺癌中取得。我們?cè)? 這些老鼠中使用Cre/Lox技術(shù)，有條件地從乳腺中刪除了TGF-βII。細(xì)胞被培養(yǎng)在一個(gè)37°C、 濕化5%的溫箱中，並且培養(yǎng)於添加了10% FBS(HyClone)的DMEM(Cellgro; Mediatech Inc.) 中。 TGF-β1的生物檢測(cè)。貂肺臟內(nèi)皮報(bào)告細(xì)胞(mink lung epithelial reporter cell)在PAI-1啟動(dòng) 子控制下，穩(wěn)定地表現(xiàn)螢火蟲luciferase。這些細(xì)胞接種於12-well 培養(yǎng)皿上 (2x105 /well)並且 留置過夜供其貼附。已知濃度的可溶性TGF-β1或肺臟組織的細(xì)胞裂解液(250μg/well)加入了 三次，而這些細(xì)胞被留在5%二氧化碳、37°C的環(huán)境下培養(yǎng)了另外24小時(shí)。在清洗之後，這 些細(xì)胞被收取至200μg/well的裂解緩衝液中(Dual Luciferase Kit; Promega)，luciferase的活性 則是在依據(jù)廠商提供的實(shí)驗(yàn)步驟下進(jìn)行了測(cè)量。 DNA萃取與聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)。以石蠟固定的腫瘤切片被取出和重新添加水分。趁 著還潮濕的時(shí)候，腫瘤部分以經(jīng)消毒之刀片刮取至經(jīng)消毒的eppendorf管中。DNA萃取是使 用Instagene (Bio-Rad)並依廠商提供的實(shí)驗(yàn)步驟所完成。DNA樣本儲(chǔ)存在-20°C，除非要另外 使用。Cre誘導(dǎo)的PyVmT/TGFBR2KO腫瘤重組，是用PCR引子以及前述之反應(yīng)條件下所驗(yàn)證 的。 眼窩後(retroorbital)血液收集以及TGF-β1之定量。老鼠以1%-2% isofluorane麻醉。血液 (約250μl/老鼠)採集於眼睛裡的結(jié)膜靜脈，作法是使用肝素化之Natelson tube (Fisher Scientific) 然後再移轉(zhuǎn)到肝素化的(heparinized)玻璃管中。血漿的製備是使用Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences)並依照廠商之使用說明進(jìn)行，且增加了一個(gè)步驟，即在4°C下以 10000g離心十分鐘以除去血小板。為測(cè)量PyVmT表現(xiàn)型細(xì)胞之培養(yǎng)基中的TGF-β1，1 x 106 的細(xì)胞被塗佈在含在完全培養(yǎng)基的10 mm盤上，並且供其貼附。該培養(yǎng)基在隔天被更換成無 血清之培養(yǎng)基。隔夜培養(yǎng)後，細(xì)胞被施以1.25-7.5 Gy。過72小時(shí)後，培養(yǎng)基經(jīng)收集並以快速 真空法濃縮(3 ml to 500μl)。老鼠的血漿和受細(xì)胞條件培養(yǎng)基（cell-conditioned medium），均 在下一步的TGF-β1的Quantikine Elisa kit (R&D Systems)中接受測(cè)試，依照的是廠商提供的實(shí) 驗(yàn)步驟。標(biāo)準(zhǔn)曲線以31.5–2,000 pg/ml的人類重組TGF-β1繪出後，被用來計(jì)算TGF-β在老鼠 血漿與細(xì)胞培養(yǎng)基中的等量。每項(xiàng)標(biāo)本都在另外的重製實(shí)驗(yàn)中重複檢驗(yàn)了三次。 TGF-β2之定量。依照廠商提供之實(shí)驗(yàn)步驟，在酸活化之後，血漿標(biāo)本以TGF-β2 Quantikine Elisa kit (R&D Systems)測(cè)試。標(biāo)準(zhǔn)曲線以31.5–2,000 pg/ml的人類重組TGF-β2繪 出後，被用來計(jì)算TGF-β2在老鼠血漿的等量。每項(xiàng)標(biāo)本都在另外的重製實(shí)驗(yàn)中重複檢驗(yàn)了 三次。 老鼠的放射處理。MMTV/PyVmT基因轉(zhuǎn)殖老鼠或正常的FVB母老鼠(Harlan)，在麻醉後 把背部固定在鏡臺(tái)上。我們使用了單一的胸前輻射場(chǎng)，並使用了鉛塊掩護(hù)老鼠身體的其他 部分。在某些實(shí)驗(yàn)中則是使用了一個(gè)單一腹部輻射場(chǎng)。老鼠被施加300 kVp 的X光，其劑量 為 2.05 Gy/min。所有的老鼠都依照此法規(guī)Institutional Animal Care and Use Committee of Vanderbilt University Medical Center，被留在一個(gè)專門的無病原空間中。在動(dòng)物暴露在放射 線或其他處理後，餵食正常食物，並且詳細(xì)觀察是否有任何情緒不穩(wěn)的跡象。 小紅莓(doxorubicin)的處理。53天大的MMTV/PyVmT老鼠，經(jīng)腹腔注射三次溶解於食 鹽水液中的doxorubicin (Adriamycin; 5 mg/kg; Sigma-Aldrich），每次間隔21天，直到第95天 止。經(jīng)無效空白試劑或小紅莓處理之老鼠，其血液樣本和肺臟組織，都於第107天解剖取得。 為了要檢查小紅莓處理之後的循環(huán)中腫瘤細(xì)胞，經(jīng)無效空白試劑或小紅莓處理之老鼠，其 血液在取得24小時(shí)後，又加入了單一劑量(5 mg/kg)。 偵測(cè)循環(huán)中腫瘤細(xì)胞。循環(huán)中腫瘤細(xì)胞之培養(yǎng)方法如前述，僅有少部分之修改。扼要 地說，血液取得於心臟穿刺。細(xì)胞懸浮液（包括buffy coat以及紅血球）從血漿中分離出後， 接種在6-well盤上，這些盤上佈有了生長激素減量之Matrigel (BD Biosciences)，並添加有 DMEM、10%FBS，之後便於37°C、5%二氧化碳之溫箱中培養(yǎng)。隔天，在每個(gè)well使用了紅 血球移除緩衝液(4.15 g NH4Cl, 0.5 g NaHCO3, 0.0186 g disodium EDTA in 200 ml water)以及 PBS，數(shù)次緩和的沖洗。DMEM與10%FBS(3ml/well)添加後，新鮮的培養(yǎng)基每三天將會(huì)補(bǔ)充 一次。過了10-12天後，以人工計(jì)數(shù)大小為50μm以上之細(xì)胞集落。PyVmT表現(xiàn)是用免疫細(xì)胞 化學(xué)方法來偵測(cè)的。扼要地說，吸出培養(yǎng)基、以PBS清洗wells，然後細(xì)胞集落以10%中性緩 衝的福馬林(formalin)，在室溫下固定30分鐘，再用PBS清洗2次，再於室溫下與PBS中之 3%BSA共存1小時(shí)。培養(yǎng)盤接著培養(yǎng)隔夜，於4°C置放於含有生物素標(biāo)記的抗PyVmT的老鼠 單株抗體(diluted 1:500, BIOT-115L; Covance)。然後，加入與streptavidin結(jié)合之螢光二級(jí)抗 體(Oregon Green 488; Invitrogen) 室溫下1小時(shí)，之後使用Hoechst 細(xì)胞核染色法(1 μg/ml 十 使用分鐘)。免疫螢光是以Leica DM IRB 倒置顯微鏡所觀察的。 生產(chǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體以及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。MMTV/PyVmT細(xì)胞，是以luciferase之載體穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染的。一個(gè)luciferase cassette從pGL3-Basic (Promega)裁切下來，並嵌入pMSCV-puro (Clontech) 之多重複製位上。amphotropic packaging Phoenix cells 轉(zhuǎn)染後，產(chǎn)生感染性病毒顆粒，如前 述。培養(yǎng)生長中(subconfluent)之癌癥基因表現(xiàn)細(xì)胞，在4 μg/ml Polybrene (Sigma-Aldrich)中， 以病毒上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí)，而含有病毒顆粒的培養(yǎng)基在6小時(shí)之後更換；在48小時(shí)後，再添 加含有10%已經(jīng)加熱變性之FCS的DMEM，並於7-10天後將抗藥的細(xì)胞集落合併。 腫瘤產(chǎn)生能力以及腫瘤轉(zhuǎn)移之研究。在1%–2% isofluorane 之麻醉下，MMTV/PyVmT/Luc 細(xì)胞(2 × 106 cells in 200 μl PBS) 被注射於FVB母鼠的左側(cè)四號(hào)乳腺脂肪墊。扼要地說，在注 入腫瘤細(xì)胞之前，脂肪墊便已經(jīng)以手術(shù)使其暴露在外，而傷口以乾淨(jìng)夾子密合，並於10天 之後取走。每週以生物發(fā)光法檢查腫瘤兩次，並系列地以測(cè)徑器測(cè)量之。這些腫瘤的以立 方公釐(mm3 )計(jì)算之體積，是以此數(shù)學(xué)式計(jì)算：v = (w2 × l)/2，v代表體積，w代表寬度，l代 表長度。當(dāng)腫瘤達(dá)到了200 mm3 或更大的體積（約兩週時(shí)間），老鼠就被施以放射線處理， 或是不作任何處理。老鼠繼續(xù)每週兩次接受生物發(fā)光法的監(jiān)控觀察，直到實(shí)驗(yàn)終結(jié)。兩週 之後，將老鼠犧牲並取得基本的腫瘤與肺臟。以解剖顯微鏡計(jì)算肺臟表面之癌癥轉(zhuǎn)移數(shù)， 之後這些肺臟以10%中性緩衝之福馬林(formalin)固定之。固定好的腫瘤切片，以H&E染色 之，並以顯微鏡檢查是否有肺癌之轉(zhuǎn)移。血液是由心臟穿刺取得以如前述，測(cè)量TGF-β之濃 度以及循環(huán)中之腫瘤細(xì)胞數(shù)。 在其他的情形裡，我們使用了MMTV/PyVmT、PyVmT/TGFBR2flox/flox或PyVmT/TGFBR2KO 細(xì)胞來表現(xiàn)luciferase。2.5 × 106 之單一細(xì)胞懸浮液製備後，重新溶於無菌之PBS液中。0.5 × 106 (in 200 μl)的細(xì)胞被注射入FVB母鼠之側(cè)面尾部靜脈中。靜脈注射24小時(shí)後，腫瘤細(xì)胞於 老鼠肺部之位置，以生物發(fā)光法確定之，並且自此之後每週追蹤兩次。為了要在活體內(nèi)阻 斷TGF-β，在把10 Gy注入老鼠胸腔的前24小時(shí)，將15 mg/kg的2G7注入老鼠腹腔內(nèi)，每週兩 次，持續(xù)進(jìn)行，直到老鼠死亡。 生物發(fā)光法顯影技術(shù)。要將生物發(fā)光之訊號(hào)與腫瘤負(fù)載量建立定量的對(duì)應(yīng)關(guān)係，先以 溶解於去離子水的 luciferin substrate (d-luciferin potassium salt; Promega)進(jìn)行腹腔注射(0.15 mg/g body weight)，在注射之後12分鐘內(nèi)取得影像。根據(jù)我們之前的時(shí)間記錄之實(shí)驗(yàn)，在此 時(shí)間記錄訊號(hào)高峰處之強(qiáng)度（資料未呈現(xiàn)）。在取得影像時(shí)，將老鼠以isofluorane麻醉。生 物發(fā)光顯影是以Vanderbilt University Small Animal Imaging Center的 IVIS-200 顯影系統(tǒng) (Xenogen)完成的。我們採用了3-5分鐘的整合計(jì)算時(shí)間，並使用on-chip binning of 8，以增加 訊號(hào)-雜訊比。生物發(fā)光顯影之定量分析是以Living Image software (Xenogen)完成，我們?cè)? 此定義了感興趣區(qū)域（regions of interest，ROI）並測(cè)量了integrated photon counts。 統(tǒng)計(jì)。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以雙尾Student’s t test分析。P值小於0.05被視為顯著。 表一 穩(wěn)定表現(xiàn)luciferase的MMTV/PyVmT細(xì)胞，被注射入FVB老鼠的右側(cè)鼠蹊乳腺脂肪墊中。擁 有200mm3 以上腫瘤的老鼠，不加以放射處理，或是在胸腔施加10 Gy的放射處理。在24小時(shí) 及2週後，以心臟穿刺取得血液，並測(cè)量細(xì)胞懸浮液在活體外形成細(xì)胞集落的能力，如「方 法」文中所示。數(shù)據(jù)為兩個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)中，每組五隻老鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。RT是指放射治 療（radiation therapy）。在同一時(shí)間點(diǎn)下，AP = 0.016 versus 0 Gy。 圖一 放射線與化學(xué)治療增加循環(huán)中TGF-β1濃度。 (A) 10 Gy 的放射線被施加於FVB老鼠之胸腔 (thorax) (左)或骨盆腔(pelvis )(右)。24小時(shí)之後取得血液，血漿中之TGF-β1濃度以在「方法」 中所述測(cè)量。(B) 八週大、帶有腫瘤之MMTV/PyVmT 老鼠，或非基因轉(zhuǎn)殖之FVB 老鼠，在 四號(hào)乳腺脂肪墊帶有200mm3 以上大小之腫瘤，不作任何處理或施加10 Gy 於胸腔。血漿中 TGF-β1 濃度，24小時(shí)後測(cè)量之。(C) 在第八週起，每隔21天，以空白試劑或腹腔注射小紅 莓 (5 mg/kg i.p.)，處理基因轉(zhuǎn)殖老鼠三次。血漿中TGF-β1濃度在第十五週測(cè)量之。A–C 之 數(shù)據(jù)代表三個(gè)不同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組使用三個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。(D) FVB老鼠胸腔被施加10 Gy。 五週後，取得經(jīng)放射線處理、控制組老鼠之肺臟，及其細(xì)胞裂解液(250 μg/ml)，加到含有貂 肺上皮細(xì)胞的 triplicate wells ，這些細(xì)胞會(huì)穩(wěn)定地表現(xiàn) plasminogen activator inhibitor–1/luciferase reporter (PAI-1/luciferase reporter)。二十四小時(shí)後，測(cè)量luciferase之表 現(xiàn)，方法如「方法」部分中所述。圖示：*表示P < 0.05， **表示P < 0.01， ***表示P < 0.001 相對(duì)於控制組。 圖二 放射線與化學(xué)治療增加循環(huán)中腫瘤細(xì)胞量以及肺部之腫瘤轉(zhuǎn)移。(A) MMTV/PyVmT母鼠在 八週大時(shí)，接受胸腔放射線處理。在第十三週時(shí)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)終結(jié)，以心臟穿刺取得血液，並 量取其細(xì)胞懸浮液在體外產(chǎn)生細(xì)胞集落之能力，如「方法」中所述。CTCs代表循環(huán)中腫瘤 細(xì)胞（circulating tumor cells）。在下面為一些具有代表性的影像，是由血液中取得、循環(huán) 中單一個(gè)腫瘤細(xì)胞形成的細(xì)胞集落�；�因轉(zhuǎn)殖成功的細(xì)胞集落，用PyVmT抗體和螢光之次 級(jí)抗體處理，並以螢光顯微鏡觀察並估計(jì)之。(B) 與A 同樣之老鼠，在第十三週大時(shí)計(jì)算 肺部表面癌癥之轉(zhuǎn)移數(shù)目。A和B中之?dāng)?shù)據(jù)是代表三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每組中有四隻老鼠。從 控制組以及經(jīng)放射線處理之基因轉(zhuǎn)殖老鼠上，取得具代表性之 H&E 染色的肺部組織切 片。這些切片是胸腔放射處理後五週所取得，如下方所示。黑色箭頭所指為肺部癌癥轉(zhuǎn)移。 (C) 八週大、帶有腫瘤的 MMTV/PyVmT 基因轉(zhuǎn)殖老鼠，每隔21天以空白試劑或腹腔注射小 紅莓(5 mg/kg i.p.)處理共三次。此實(shí)驗(yàn)於第十五週時(shí)終結(jié)，並計(jì)算肺部表面之癌癥轉(zhuǎn)移數(shù) 量。具代表性之H&E染色肺部切片，其含有癌癥轉(zhuǎn)移部分的中心如右方圖示。原始放大倍 率為100倍。*表示P < 0.05， **表示P < 0.01 ，相較於控制組。 圖三 胸腔放射線會(huì)增加殖入腫瘤至肺部的癌癥轉(zhuǎn)移。(A) 穩(wěn)定表現(xiàn)luciferase的MMTV/PyVmT 細(xì) 胞，被注入同源FVB老鼠之乳腺脂肪墊中。之後，兩週一次，以生物發(fā)光顯影法監(jiān)測(cè)腫瘤生 長以及肺部癌癥轉(zhuǎn)移。圖示為一具代表性之老鼠，圖為細(xì)胞注入兩週之後所攝(B與C)。帶 有至少200 mm3 PyVmT/Luc腫瘤的老鼠，以胸腔放射線(10 Gy)處理之或不施加任何處理。 (B) 肺部癌癥轉(zhuǎn)移在兩週之後定量。數(shù)據(jù)為每兩次實(shí)驗(yàn)中之一次，每組五隻老鼠之平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。**表示P < 0.01 相較於控制組 (C) 肺部與原發(fā)腫瘤之H&E 切片。原始放大倍率為 100倍。 圖四 放射線的先行處理，會(huì)使移轉(zhuǎn)的肺癌細(xì)胞更能夠拓展在原本無腫瘤的老鼠身上。(A) MMTV/PyVmT 細(xì)胞，在加有不含血清之培養(yǎng)基之100-mm 培養(yǎng)皿裡，以1.25–7.5 Gy處理。 受細(xì)胞所影響之培養(yǎng)基在72小時(shí)後進(jìn)行收集，並以如「方法」中所述之ELISA得知TGF-β1 之濃度。(B) 穩(wěn)定表現(xiàn)luciferase之MMTV/PyVmT 細(xì)胞，由尾部靜脈注入未交配之FVB母鼠。 在接受細(xì)胞注射1小時(shí)之前，老鼠在圖中所標(biāo)部分之胸部，以10 Gy處理之。在注射之後2週， 肺部之癌癥細(xì)胞以老鼠的生物發(fā)光法進(jìn)行視覺觀察（頂圖）。某些情形中，肺臟在添加 d-luciferin之後被手術(shù)移除，並於體外進(jìn)行顯影（底圖）。控制組如左圖所示，受放射線處 理之老鼠如右圖所示。(C) 具代表性的整體肺部載片（頂圖）以及控制組與放射線處理組之 H&E肺部切片(底圖；原放大倍率為100)。(D) 在控制組與放射線處理老鼠中，肺部表面癌 癥轉(zhuǎn)移之定量（左圖）與肺部重量（右圖）。數(shù)據(jù)為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組的五隻老鼠的 平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖示：**表示P < 0.01， ***表示P < 0.001 ，相較於控制組。 圖五 TGF-β中和抗體2G7，阻斷了放射線誘導(dǎo)增加的肺部癌癥轉(zhuǎn)移。(A和B) 八週大、 帶有腫瘤 的MMTV/PyVmT老鼠於胸腔接受10 Gy處理。在圖中標(biāo)出之部分，老鼠被每週兩次施以15 mg/kg 的2G7，直到第十三週。此時(shí)進(jìn)行肺部表面之癌癥轉(zhuǎn)移計(jì)數(shù)。(A) 數(shù)據(jù)為每組中五隻 老鼠的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。(B) 代表性的H&E 染色肺部切片。此實(shí)驗(yàn)重複一次取得了類似 的結(jié)果。(C) 當(dāng)實(shí)驗(yàn)終結(jié)，以心臟穿刺取得血液，並量取其細(xì)胞懸浮液在體外產(chǎn)生細(xì)胞集落 之能力，如「方法」部分中所述。(D) 在第十三週，經(jīng)過胸腔放射處理、帶有腫瘤的基因轉(zhuǎn) 殖鼠，收集血液。細(xì)胞懸浮液如C圖中情形，在20 μg/ml 2G7或PBS環(huán)境下，塗佈於培養(yǎng)盤 上。10-12天後，人工計(jì)數(shù)等於或大於50 μm的細(xì)胞集落。數(shù)據(jù)為每組五隻老鼠的平均值±標(biāo) 準(zhǔn)差。*表示P < 0.05， **表示P < 0.01 相較於控制組。 圖六 腫瘤細(xì)胞中不存在TGFβRII，能抵銷受放射線誘發(fā)的肺部癌癥轉(zhuǎn)移之增加。(A–C) 未交配 的、八週大的FVB母鼠，從尾部靜脈注入穩(wěn)定表現(xiàn) luciferase的PyVmT/TGFBR2flox/flox 與 PyVmT/TGFBR2KO 細(xì)胞。這些老鼠在注射腫瘤細(xì)胞之前，一組接受、一組未接受胸腔的10 Gy 處理。兩週後，以生物發(fā)光(A)、組織染色(B)、以及人工計(jì)數(shù)肺部表面癌癥轉(zhuǎn)移(C)的方法， 來測(cè)定肺部表面癌癥轉(zhuǎn)移，如「方法」中所述。資料為每組中四隻老鼠的平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差。 (D) 兩組細(xì)胞株的基因體DNA之PCR結(jié)果，顯示重組片段的僅存在於PyVmT/TGFBR2KO 細(xì) 胞中。**表示P < 0.01 相較於控制組。 譯者：Jeffrey Chu at Hsinchu, Taiwan. 2009/4/4 不免有所遺漏、錯(cuò)誤，敬請(qǐng)參考與指正，謝謝。